Ained ja segud: Ekstraheerimine: Planaarkromatograafia: värsked taimelehed heksaan (~3 ml) heksaan (~10 ml) etüülatsetaat (~1 ml) etanool (~5 ml) destilleeritud vesi Töövahendid: Ekstraheerimine: Planaarkromatograafia: statiiv ja rõngas Eppendorfi tuub mõõtsilindrid planaarkromatograafiaplaat uhmer ja uhmrinui voolutusnõu koos kaanega süstal ja filterpaber pliiats, joonlaud, pintsetid, spaatel jaotuslehter automaatpipetiotsikud keeduklaas Kasutatavate kemikaalide füüsikalised omadused ja ohutus:
Molekulaar- ja rakubioloogia praktikum Aruanne Koostanud: Luise Tiks YASB61 112332 Tallinn 2014 Pipeteerimine Harjutus 1 1 ml pipetti kasutades pipeteerisin 15-ml falconisse 1,65 ml detergenti, 3,85 ml vett (kokku 5,5 ml 30% lahust). Detergendi pipeteerimiseks kasutasin pahupidi tehnikat. Pipeteerisin kahte eppendorfi 1,55 ml lahust, allesjäänud 2,4 ml pipeteerisin 200 l kaupa eppendorfidesse sain 11 ja pool eppendorfi. Harjutus 2 Hindasin silmaga vee koguseid: 1. 200 l 2. 60 l 3. 100 l 4. 20 l 5. 7 l 6. 90 l 7. 40 l 8. 150 l Hinnangud polnud küll päris täpsed, aga siiski küllaltki lähedased. Harjutus 3 Pipeteerisin laual oleva plaadi viide auku 100 l broomfenoolsinist, lisasin vastavalt 50 l, 5 l, 1 l ja 0,5 l. Lisaks lisasin juhendist erinevalt ühte auku 20 l, ning pipeteerisin uue
Külmas säilitatuna on reagent väga stabiilne (1 aasta). 2. 1 M NaOH lahus, kasutatakse juhul, kui valk pole lahustuv värvaine lahuses. 3. Tee standardvalgu (BSA) lahjenduste rida: 1 mg/ml 0,5 mg/ml 0,2 mg/ml 0,1 mg/ml 0,05 mg/ml 4. Terve grupi peale on antud 5x Bradfordi reagendi stock. Lahjenda see 25 ml-s, et oleks 1x stock. 25 ml kohta lisa 100 µl 5M NaOH. Lahustina kasuta mQ vett. 5. Pipeteeri igasse eppendorfi 1,5 ml 1x Bradfordi reagenti ning lisa 50 µl BSA valgulahust erineva kontsentratsiooniga. Viimasesse eppendorfi pipeteeri samuti 1,5 ml 1x Bradfordi reagenti ning lisa 50 µl uuritava valgulahust tundmatu kontsentratsiooniga. Sega korralikult. Lase reaktsioonil toimida 10 minutit. Sellel ajal seadista spektrofotomeetrit. 6. Iga grupi peale on 1 spektrofotomeeter, milles on 578 nm või 546 nm filter. Kõigepealt lülita sisse seade (AusEin). Seejärel oota u
TLC plaadile kantud 2 μl proovi ja rasvhappe (AA) standardit (1 μg/μl). Plaati elueeriti, seejärel ilmutati fosformolübdeenhappe 2,5% etanoolilahuses. Rasvhapete metüleerimine Metüleerimiseks võeti 10 μl proovi. Lahusti aurustati inertgaasiga puhudes. Proov lahustatud 25 μl metanoolis ja loksutatud. Lahusele lisatud 100 μl diasometaani eetrilahust, avatud kaanega eppendorf pandud 37°C termoblokki kuni lahusti oli enamjaolt pealt ära auranud. Jääk puhuti inertgaasiga minema. Eppendorfi lisatud 25 μl metanooli. Metüleerimise kontroll ja gaaskromatograafliste proovide ettevalmistamine Metüleerimise toimumist kontrolliti TLC meetodil, samamoodi kui eespool. Metüleeritud proov kantud GC proovipudelisse ning antud analüüsi. Tulemused TLC analüüsi käigus ilmutatud plaadilt oli näha, et proovi pleki suurus oli ligikaudu 4,5x suurem kui standardi oma, mis tähendab, et kui standardi plekis sisaldus umbes 2 μg
intensiivsuse alusel mõõdetuna vastaval lainepikkusel. Töö käik: Meil on olemas ELISA plaat 16-ne süvenditega. Süvenditesse me kanname erinevate kontsentratsioonidega lehtede proovid viirusega või viiruseta. L- terve, L+ viirusega ELISA plaat 1 2 Igasse süvendisse kanname 100µl proovi. A L- L- 1:10 Taimelehest eraldame mahl spetsiaalse B L- L- 1:20 mahlapressi abil ja eppendorfi- tuubis C L- L- 1:50 lahjendame selle vajaliku D L- L- 1:10 kontsentratsioonini PBS-ga. 0 Plaadilt eemaldame mitteseostunud E L+ L+ 1:5 antigeeni ja peseme plaate 4x PBS/ Tw-ga F L+ L+ 1:10 G L+ L+ 1:50 ja 1x PBS- ga.
ELISA plaat 1 2 A L- L- 1:10 B L- L- 1:20 C L+ L+ 1:10 D L+ L+ 1:100 E M- M- 1:10 F M+ M+ 1:10 G PBS+Vii PBS r. H PBS PBS · Igasse süvendisse kanname 100µl proovi. · Taimelehest eraldame mahl spetsiaalse mahlapressi abil ja eppendorfi- tuubis lahjendame teda vajaliku kontsentratsioonini PBS-ga. Tuleb välja kaks proovi 1:10 ja 1:20, need on proovid ilma viiruseta. · Lehe proovi viirusega saame õppejõust. · Edasi valmistame mugulamatrejalist mugula proovi viirusega. Selleks võtame umbes 1g mugulat ja pressitakse välja mugula mahl, lahjendame teda PBS-ga vajaliku kontsentratsioonini. · Mugula proovi viiruseta saame õppejõust.
Enne pipeteeritavasse lahusesse viimist vajuta kolb esimese astmeni alla. Pipeti tühjenemiseks on vaja vajutada kolb teise astmeni. Viskoosse lahuse pipeteerimine Vajalikud materjalid: pesuvahendi kontsentraat, vesi, pipetid koos otsikutega, falcon tuub, aukudega plaadike Töö käik: 1. Kasutades 1 ml pipetti tegin 15-ml falconisse 5,5ml 30% homogeenset pesuvahendilahust (1,65 ml peduvahendit ja 3,85 ml vett) 2. Pipeteerisin kahte eppendorfi 1,55 ml lahust (mõlemasse) 3. Pipeteerisin alles jäänud lahus 200 μl kaupa plaadi aukudesse. Lahust jätkus 10 augu jaoks. Järeldus: lahust pidi jätkuma 12 augu jaoks, kuna pärast eppendorfi pipeteerimist jäi 5,5 – 2 ∙ 1,55 = 2,4 ml lahust. Ja kui pipeteerida 200 μl (0,2 ml) kaupa, pidi olema täidetud 2,4/0,2 = 12 augu. Viga võiks tulla ebatäpsest esialgse lahuse pipeteerimisest ja kindlasti sellest, et
............................... 69 I RAPD-PCR REAKTSIOONI ETAPP – DNA ERALDAMINE PCR reaktsiooniks on vaja DNA vabastada bakerirakust. See kehtib nii puhaskultuuri kui vahetult kliinilise materjali korral. Üks lihtsamaid DNA vabastamise meetodeid on bakterite termiline töötlemine. Kuumuse mõjul bakteri sein puruneb ja DNA vabaneb ümbritsevasse keskkonda. 1) Valmistada kuumutamiseks bakterite suspensioon 1,5 ml Eppendorfi katsutis. Selleks pipeteerida automaatpipetiga Eppendorfi katsutisse 10 µl steriilset destilleeritud vett. Lisada steriilse pulgaga Petri tassilt 1 koloonia, segada vorteksil kuni kaovad kõik nähtavad tükid. 2) Mikroobisuspensiooni kuumutamine DNA vabastamiseks. Asetada valmistatud bakterite suspensioon PCR masinasse, kuumutada suspensioone 950 C juures 10 min jooksul (spetsiaalne programm). II RAPD-PCR REAKTSIOONI ETAPP – VAHETU PCR REAKTSIOONI TEOSTAMINE 3) PCR segu valmistamine
annaabi.ee 
