2.kloneerimisala (MCS) erinevate restriktaaside lõikekohad; 3.uuritavat järjestust (valkude korral tavaliselt cDNA kujul); 4.reportergeeni (GFP, lutsiferaas, lacZ jt.) või märgise (tag; FLAG, myc, V5, GFP) järjestust. 5.eukarüootset promootorit (CMV, SV40) ja polüadenüleerimisjärjestust (SV40); 6.selektsioonimarkeri ekspressioonikassetti. Praktiline töö III Immuunotsütokeemia 1. Mille poolest on erinevad monoklonaalsed ja polüklonaalsed antikehad? Mka reageerivad vaid ühe epitoobiga antigeeni molekulis, on väga spetsiifilised 2. Mis on epitoop? Too välja kaks erinevat tüüpi epitoopide rühma ja kirjelda mille poolest need erinevad. Antigeeni osa, mis seostub spetsiifiliselt antikeha retseptorile. Konformatsioonilised(tertsiaarstruktuuri järgi) ja lineaarsed(aminohappejäägi järjestuse järgi) 3. Kuidas töötab fluorestsentsmikroskoop? Ergastav valgus juhitakse läbi filtri uuritava objektini. Filter laseb läbi ainult kindla
Tooge välja nimetused ja päriotolu erinevused. Monokloonsed on pärit ühe B-raku järglaskonnast ja seega identsed. Katselooma, kimäärsed, humaniseeritud ja inimese omad, eristatakse päritolu järgi. Loeng 04.04 slaid 15. Kasvajaraku ja B-lümfotsüüdi hübriidimisel saadakse sellised hübriidsed immortaliseeritud rakukloonid, mis on in vitro tingimustes võimelised tootma vaid üht kindlat tüüpi antikeha, mis on ülimalt spetsiifiline mingi kindla aine suhtes ja mis seondub vaid ühe epitoobiga – sellega, mille vastu ta on saadud. Seda osa, mis antigeeni molekulist on oluline antikeha seondumiseks, nimetatakse epitoobiks. 55. Mis on backcrossing? Analüüsiv ristamine - analüüsitava dominants(et)e tunnus(t)ega isendi tagasiristamine retsessiivse vanemaga. Kui analüüsitav organism on homosügootne, siis lahknemist ei toimu, kui heterosügootne, siis saame ühesugused geno- kui ka fenotüübiilised lahknemissuhted (1:1). 56. Mis on hübridoomi meetod ning milleks seda kasutatakse
Saab panna ensüümi valgu antikeha külge ELISA värvime antikehi floresseeruvate molekulidega visualiseerimiseks hübridiseerid filtrit antikehadega western blotting Millised on monoklonaalsed antikehad? Monoklonaalne antikeha - antikeha, mis on produtseeritud ühe raku või rakuliini poolt, mis on ühest rakust arenenud. On identsed ja omavad unikaalset aminohappe järjestust, kasvavad identselt. Reageerivad vaid ühe epitoobiga antigeeni molekulis. Homogeenset antikehade populatsiooni on võimalik saada B lümfotsüütide liitmisel kasvajarakkudega. Saadud rakuliine kutsutakse hübridoomideks . Monoklonaalsed antikehad tekivad kui ühendada B-lümfotsüüdid kasvajarakkudega, need on hübridoomid. Selektiivsöötmel jäävad ellu ainult hübridoomid. Nüüd on puhas kultuur ühte tüüpi antikehi tootavatest, hästi paljunevatest rakkudest.
immuunsüsteemi ka kauem. Epitoop - antigeenne determinant, koht antigeeni molekulil, millega reageerib B-raku retseptor (Fab fragment) või T-raku retseptor (TCR). On lineaarsed ja ruumilised epitoobid. B-rakkudel on epitoobi suurus ca 15-22 aminohapet, T-rakkudel kuni 15 aminohapet. T-rakkudel on lineaarsed epitoobid, seovad valgulisi antigeene. B-rakkudel aga on ruumilised epitoobid, nad seovad erinevaid antigeenseid determinante. B-rakkudel pole epitoopi, vaid on epitoobiga seostumise ala (Fab), samuti T-rakkudel. Paratoop: idiotoop või antigeenne ala antikehal või T-raku retseptoril, mis on seotud antigeeni epitoobi seostamisega. B-rakkude poolt äratuntavaid epitoope iseloomustab: Ehituselt: polümeeri primaarjärjestus, st lineaarsed või korduva järjestusega determinandid; sekundaarne, tertsiaarne, kvaternaarne molekulstruktuur, st konformatsioonilised. Suuruselt: antikeha Fab-fragment seob 4-8 aminohappejääki.
IgG antikehi. 4. Antiseerum saadakse looma verest. Lastakse hüübida, eemaldatakse erütrotsüüdid ja teised vererakud ning mõningad seerumvalgud. 5. Antikehade puhstamine antiseerumist. Homogeenset antikehade populatsiooni on võimalik saada B lümfotsüütide liitmisel kasvajarakkudega. Saadud rakuliine kutsutakse HÜBRIDOOMIDEKS. Toodavad ühte kindlat liiki antikehi MONOKLONAALSEID ANTIKEHI (MKA). Reageerivad vaid ühe epitoobiga antigeeni molekulis. On identsed antikehad, toodetakse ühe klooni poolt. B-RAKKUDE ARENG hõlmab kahte faasi: 1) AG-sõltumatu B-rakkude küpsemise faas luuüdis; 2) küpsete B-rakkude antigeenist sõltuv aktivatsioon ja differentseerumine perifeerias, mille tulemusena tekivad antikehi sekreteerivad plasmarakud ja mälu B-rakud. B-rakkude areng saab alguse lümfoidsetest tüvirakkudest, need prolifereeruvad ja differentseeruvad pro-B
Eelis: tekitab lisa mitmekesisuse CDR3 hüpervariaablis regioonis Puudus: võivad tekkida paardumata nukleotiidid, lugemisraam võib minna katki. 11. Monoklonaalsete antikehade valmistamise põhimõte ja kasutamine teraapias. Milline peaks olema edukas ravim? Monoklonaalne antikeha on antikeha, mis on produtseeritud ühe raku või rakuliini poolt, mis on ühest rakust arenenud. On identsed ja omavad unikaalset aminohappe järjestust, kasvavad identselt. Reageerivad vaid ühe epitoobiga antigeeni molekulis. Hiirt immuniseeritakse antigeeniga, eraldatakse põrnarakud, fuseeritakse müeloomi rakkudega, kasvatatakse HAT söötmel (Aminopteriin blokeerib nukleotiidide sünteesi põhiraja ning HGPRT defekti tõttu ei saa müeloomirakud kasutada alternatiivseid substraate ja surevad, vanuse tõttu hukkuvad ka põrnarakud. Alles jäävad vaid hübridoomid.), isoleeritakse üksikutest hübridoomidest pärinevad rakukloonid, mis
Normaalsetel isenditel on IgE hulk vereseerumis väga väike, allergia või parasiitsete nakkuste tõttu suureneb see patsientide veres kuni tuhat korda. 14. Polüklonaalsed antikehad. Monoklonaalsed antikehad (Hübridoomi tehnoloogia) Monoklonaalne antikeha on antikeha, mis on produtseeritud ühe raku või rakuliini poolt, mis on ühest rakust arenenud. On identsed ja omavad unikaalset aminohappe järjestust, kasvavad identselt. Reageerivad vaid ühe epitoobiga antigeeni molekulis. Homogeenset antikehade populatsiooni on võimalik saada B lümfotsüütide liitmisel kasvajarakkudega. Saadud rakuliine kutsutakse hübridoomideks . PKA tunnevad ära ja seostuvad paljude epitoopidega antigeeni molekulid. Saadakse loomade (kits, küülik jne) korduval süstimisel vastava antigeeni lahusega. Vereseerum kogutakse organismist antikehade produktsiooni tipul. Sel viisil on võimalik saada spetsiifilist IgG-d ligi 1-10mg/ml seerumi kohta
annaabi.ee 
