viisin selle kolonni, jättes pipeti otsa umbes 5 mm kaugusele geeli pinnast. Proovil lasin voolata (tilkuda) geeli pinnale nii, et see seal võimalikult ühtlaselt jaotuks. Uuritavad segud Koosnes 3-st erineva molekulmassiga komponendist. Segus olid kõik ained värvilised, et komponentide lahutumine oleks kolonnis ka visuaalselt jälgitav ja geelkromatograafia põhimõte arusaadavam. Ühe komponendina sisaldas praktikas uuritav segu dekstraansinist (3mg/ml), mis elueerus minimaalse väljumismahuga ja mille järgi sain teada kasutatava kolonni vaba mahu (Vxmin = Vv). Dekstraansinine on kõrgmolekulaarne dekstraan (Mr = 2*106), mille külge on kovalentselt seotud sinine värvaine, mistõttu ta omab neeldumismaksimumi max lainepikkusel 625 nm. Lisaks sisaldas uuritav segu Müoglobiini (6mg/ml), mille molekulmass on 16800 Da ja DNP- aspartaati (0,3 mg/ml). Kolonni voolutamine
Kui vedeliku tase kolonnis langeb täidise pinnani, suletakse kiiresti kolonni väljavooluava ja kolonn on valmis uuritava proovi sisestamiseks. Proovi sisestamine Et proovi sisestada tuli võtta 1 ml mõõtpipett, millega pandi geeli pinnale, võimalikult ühtlaselt 0,5 ml uuritavat proovi. Sellel ajal pidi kolonni väljavooluava olema suletud. Uuritavad segud Uuritava seguna kasutasime selles praktikumis dekstraansinist, mis elueerub minimaalse väljumismahuga ja mille järgi saab teada kasutatava kolonni vabamahu (Vx min = Vv ). Samuti sisaldas uuritav segu ka müoglobiini ja D-aspartaati. Kolonni voolutamine Esmalt kogume kolonnist puhta vooluti ühte väiksesse keeduklaasi ja mõõdame selle mahu v=>15,45 ml. Seejärel võime hakata koguma proove, kuid esmalt veendume, et
max Vx n= 2ml 79, 8 ml n= 2 ml = 39,9 = 40 Seejärel lasen eluenti (0,15 M NaCl lahus) kolonnist keeduklaasi, kuni eluendi tase kolonnis langeb täidise piirini. Pean silmas, et vedelikunivoo alla täidise piiri ei langeks, muidu satub geelikihti õhk, mis võib katsetulemusi mõjutada. Hoides kolonni väljavooluava suletuna, pipeteerin 0,5 ml uuritavat ainet ühtlaselt geeli pinnale ning lasen sellel valguda läbi geeli. Uuritav lahus sisaldab dekstraansinist, müoglobiini ja DNP-aspartaati (vedelik on algul rohelist värvi). Seni, kuni dekstraansinine (mis on kõige kiiremini liikuv aine) jõuab kolonni alaossa, kogun vooluti (seda pidevalt lisades) ühendatud fraktsioonina keeduklaasi. Mõõdan selle koguse sobiva mõõtsilindriga ära ning saan tulemuseks Vüf=20,65 ml. Kui sinise värvusega dekstraansinine on jõudnud kolonni alaossa, võtan ühendatud fraktsioonina kogutud keeduklaasi alt ning hakkan fraktsioone 2 ml
Esimesena väljus kolonnist dekstraansinine, mis tõestab, et sellel on kõige suurem molekulmass. Tänu sellele ei difundeerunud ta geeli pooridesse, vaid väljus kolonnist graanulite vahelt minimaalse elueerimismahuga, mis on võrdne kolonni vaba mahu ehk graanulitevahelise vedeliku mahuga. Eluaadi maht kuni dekstraansinise kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni: Vxmin = 25,5 ml. Järgmisena väljus kolonnist müoglobiin, mis on molekulmassi suuruselt teine pärast dekstraansinist. Eluaadi maht kuni valgu kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni: Vx = 33,5 ml. Viimasena väljus kolonnist DNP-aspartaat, mis näitab seda, et selle aine molekulmass on kõige väiksem, st küllalt väike, et täielikult difundeeruda geeli pooridesse. Seetõttu liigub ta kolonnis kõige aeglasemalt ja väljub maksimaalse elueerimismahuga. Eluaadi maht kuni kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni: Vxmax = 65,5 ml. D
kolonnist väljumisel tõuseb, saavutab haripunkti ja langeb, kuni kogu aine on kolonnist väljunud. Ained jagunesid geelis vastavalt molaarmassile. Dekstraansinine, mille molaarmass oli suurim, väljus kolonnist esimesena. Tema elueerumismaht on minimaalne. Kolmandana elueerus DNP- aspartaat, mille molekulid olid lahuses väikseimad ning difundeerusid täielikult geeli pooridesse. Seetõttu on DNP-Aspartaat maksimaalse elueerimismahuga. Müoglobiin väljus kohe pärast dekstraansinist, st tema molekulmass on dektraansinisest veidi väiksem. Müogobiini ja DNP-aspartaadi väljumise vahe oli suurem, st DNP-aspartaadi molekulid on oluliselt väiksemad müoglobiini omadest. eluaadi kogumaht kuni dekstraansinise kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni Vx1= Vxmin= 33 +22= 37 ml eluaadi kogumaht kuni müoglobiini kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni Vx2= 33 + 2 8= 49 ml
· Geelkromatograafia meetodi puhul proov lahjeneb lahutamise käigus. Uuritavad segud Reeglina koosnevad segud 34 erineva molekulmassiga komponendist, mis on lahustatud destilleeritud vees, sobivas puhvris või nõrgas NaCl lahuses. Meie praktikumis uuritavates segudes on kas kõik ained värvilised, et segu komponentide lahutumine kolonnis oleks ka visuaalselt jälgitav ja geelkromatograafia põhimõte arusaadavam. Ühe komponendina sisaldavad praktikumis uuritavad segud dekstraansinist(6mg/ml), mis elueerub minimaalse väljumismahuga ja mille järgi saame teada kasutatava kolonni vaba mahu (Vxmin = Vv ). Dekstraansinine on kõrgmolekulaarne dekstraan (Mr = 2·106), mille külge on kovalentselt seotud sinine värvaine, mistõttu ta omab neeldumismaksimumi max lainepikkusel 625 nm. Teine komponent oli valk müoglobiin(6 mg/ml), mille neeldusmaksimum on lainepikkusel 410 nm. Müoglobiinil on helekollane värv. Tema molekulmass on 16 800 g/mol.Müoglobiin on väga
· Geelkromatograafia meetodi puhul proov lahjeneb lahutamise käigus. Uuritavad segud Reeglina koosnevad segud 34 erineva molekulmassiga komponendist, mis on lahustatud destilleeritud vees, sobivas puhvris või nõrgas NaCl lahuses. Meie praktikumis uuritavates segudes on kas kõik ained värvilised, et segu komponentide lahutumine kolonnis oleks ka visuaalselt jälgitav ja geelkromatograafia põhimõte arusaadavam. Ühe komponendina sisaldavad praktikumis uuritavad segud dekstraansinist(6mg/ml), mis elueerub minimaalse väljumismahuga ja mille järgi saame teada kasutatava kolonni vaba mahu (Vxmin = Vv ). Dekstraansinine on kõrgmolekulaarne dekstraan (Mr = 2·106), mille külge on kovalentselt seotud sinine värvaine, mistõttu ta omab neeldumismaksimumi max lainepikkusel 625 nm. Teine komponent oli valk müoglobiin(6 mg/ml), mille neeldusmaksimum on lainepikkusel 410 nm. Müoglobiinil on helekollane värv. Tema molekulmass on 16 800 g/mol.Müoglobiin on väga
Uuritavad segud Reeglina koosnevad segud 34 erineva molekulmassiga komponendist, mis on lahustatud destilleeritud vees, sobivas puhvris või nõrgas NaCl lahuses. Meie praktikumis uuritavates segudes on kas kõik või enamik aineid värvilised, et segu komponentide lahutumine kolonnis oleks ka visuaalselt jälgitav ja geelkromatograafia põhimõte arusaadavam. Ühe komponendina sisaldavad praktikumis uuritavad segud alati dekstraansinist, mis elueerub minimaalse väljumismahuga ja mille järgi saame teada kasutatava kolonni vaba mahu (Vxmin = Vv ). Dekstraansinine on kõrgmolekulaarne dekstraan (Mr = 2·106), mille külge on kovalentselt seotud sinine värvaine, mistõttu ta omab neeldumismaksimumi max lainepikkusel 625 nm. Allpool on toodud mõned uuritavate segude näidisvariandid. NB! Teile uurimiseks antud segu koostis ei pruugi vastata siintoodutele. Selle leiate proovi
annaabi.ee 
