Tallinna Tehnikaülikool Materjaliteaduse instituut Füüsikalise keemia õppetool Üliõpilane: Teostatud: 22.02.2012. Õpperühm: YAGB42 Kontrollitud: Töö nr. 23FK Arvestatud: Sahharoosi ensüümreaktsiooni kineetiliste parameetrite määramine Töö eesmärk: · Ensüümreaktsiooni kineetiliste konstantide K m ja Vmax määramine Lineweaver- Burki koordinaatides ehitatud graaafiku abil (1/v sõltuvana 1/S ). · Ensüümi aktiivsuse määramine (1 sekundi jooksul ärareageerivate substraadi moolide arv 1 grammi ensüümi toimel 1 sekundi jooksul). Üldmõisted: On olemas esimest järku ja teist järku kineetilised võrrandid. 1) Esimest järku kineetiline võrrand: k ühik: 2) Teist järku kineetiline võrrand: k ühik:
Polarisatsi mõõdetakse polarimeetri abil. Töövahendid. polarimeeter KRÜSS, suhkrulahus, invertaasi lahus Töö käik. Tegin vajaliku lahuse ja fikseerisin reaktsiooni algusaja. Panin lahuse katse toru teatud aja tagant vaatasin näitu ja panin selle kirja. Kõige alguses tegin katse p hiljem arvutustes teha kalibratsioon. Kõige viimase tulemuse saatis mulle labo ja vmax määramine Lineweaver-Burki s on glükoos ja fruktoos: C12H22O11 + H2O uses (kusjuures vee kontsentratsioon on tunduvalt tsioonina. Inversioonireaktsiooni kiirus on e reaktsiooni katalüsaatorite – kas mineraalhapete kiirust mõõdetakse lahust läbiva polariseeritud e kaudu. Seda võimaldab suhkru ja tema polarisatsioonitasandit paremale (eripööre [αeri] = αeri] = eri] = una glükoos pöörab paremale (eripööre [αeri] = αeri] = eri] =
Tallinna Tehnikaülikool Materjaliteaduse instituut Füüsikalise keemia õppetool Üliõpilane: Teostatud: 22.02.2012. Õpperühm: Kontrollitud: Töö nr. 23FK Arvestatud: FK23a Sahharoosi ensüümreaktsiooni kineetiliste parameetrite määramine Töö eesmärk ja üldmõisted: Eesmärgiks on ensüümreaktsiooni kineetiliste konstantide Km ja vmax määramine Lineweaver- Burki koordinaatides ehitatud graafiku abil (1/v sõltuvana 1/S). Samuti on võimalik määrata ensüümi aktiivsust (1 sekundi jooksul ärareageerivate substraadi moolide arv 1 grammi ensüümi toimel 1 sekundi jooksul ehk teiste sõnadega reaktsiooni kiirus ühikulise hulga ensüümi toimel). Üldmõisted: Erinevalt esimest järku kineetilisest võrrandist kirjeldub reaktsiooni kiirus sõltuvana substraadi kontsentratsioonist võrdhaarse hüperboolina (graafik käitub vastavalt
TTÜ Materjaliteaduse Instituut Füüsikalise keemia õppetool Kolloidkeemia laboratoorne töö 23a Sahharoosi ensüümreaktsiooni kineetiliste parameetrite määramine Eesmärgiks on ensüümreaktsiooni kineetiliste konstantide Km ja vmax määramine Lineweaver- Burki koordinaatides ehitatud graafiku abil (1/v sõltuvana 1/S). Samuti on võimalik määrata ensüümi aktiivsust (1 sekundi jooksul ärareageerivate substraadi moolide arv 1 grammi ensüümi toimel 1 sekundi jooksul ehk teiste sõnadega reaktsiooni kiirus ühikulise hulga ensüümi toimel). Töö ettevalmistamine: Reagentideks on: substraadiks suhkrulahus ja ensüümiks invertaasi lahus. Ensüümi lahus valmistatakse 0,1-0,5% (või kuni 2%) invertaasi lahusena atsetaatpuhvris (0,1M), mille pH
TTÜ Materjaliteaduse Instituut Füüsikalise keemia õppetool Kolloidkeemia laboratoorne töö 23a Sahharoosi ensüümreaktsiooni kineetiliste parameetrite määramine Eesmärgiks on ensüümreaktsiooni kineetiliste konstantide Km ja vmax määramine Lineweaver- Burki koordinaatides ehitatud graafiku abil (1/v sõltuvana 1/S). Samuti on võimalik määrata ensüümi aktiivsust (1 sekundi jooksul ärareageerivate substraadi moolide arv 1 grammi ensüümi toimel 1 sekundi jooksul ehk teiste sõnadega reaktsiooni kiirus ühikulise hulga ensüümi toimel). Töö ettevalmistamine: Reagentideks on: substraadiks suhkrulahus ja ensüümiks invertaasi lahus. Ensüümi lahus valmistatakse 0,1-0,5% (või kuni 2%) invertaasi lahusena atsetaatpuhvris (0,1M), mille pH
Edasi teostata tagant (alguses tihemini ~2 min. või 5 min, järel, siis 10 min järel, ning mida a 4) Loputatakse polarimeetri toru ja täidetakse (mullideta!) reaktsioonisegust võ polarimeetrisse ning mõõdetakse polarisatsioonitasandi pöördenurka 5) Esimene mõõtmine võetakse lühimal ajahetkel, mis võimalik. Edasi teostata tagant (alguses tihemini ~2 min. või 5 min, järel, siis 10 min järel, ning mida a ja vmax määramine Lineweaver-Burki vôrrand: atsioon; Km- Michaelis-Menteni konstant; vmax – ]0 = Km, siis v0 = ehk Km on substraadi aksimaalsest. Järeldus: mida väikesem on Km , seda üüm (ferment) efektiivselt. See kirjeldab produkti substraadi kontsentratsioonidel limiteerivad used). Kõrgetel substraadi kontsentratsioonidel on s on glükoos ja fruktoos: ioon on tunduvalt suurem sahharoosi nireaktsiooni kiirus on neutraalses keskkonnas väga kas mineraalhapete või (antud töös)
TTÜ Materjaliteaduse Instituut Füüsikalise keemia õppetool Kolloidkeemia laboratoorne töö 23a Sahharoosi ensüümreaktsiooni kineetiliste parameetrite määramine Tallinn 2013 Eesmärgiks on ensüümreaktsiooni kineetiliste konstantide Km ja vmax määramine Lineweaver- Burki koordinaatides ehitatud graafiku abil (1/v sõltuvana 1/S). Samuti on võimalik määrata ensüümi aktiivsust (1 sekundi jooksul ärareageerivate substraadi moolide arv 1 grammi ensüümi toimel 1 sekundi jooksul ehk teiste sõnadega reaktsiooni kiirus ühikulise hulga ensüümi toimel). Töö ettevalmistamine: Reagentideks on: substraadiks suhkrulahus ja ensüümiks invertaasi lahus. Ensüümi lahus
· Muudame korraga ainult ühte reaktsioonitingimust · Korduskatsed mõõtmisvea määramine Ensüümkineetika andmete analüüs Kas meie ensüümi kineetika vastab Michaelis-Menteni võrrandile? Milline on kcat ja KM väärtus? V = Vmax[S]/(KM + [S]) V versus [S] hüperbool Michaelis Menteni võrrandi lineaarsed versioonid sirge võrrandid: Sirge võrrand y = ax + b (a tõus ja b vabaliige) 1. Lineweaver-Burki kaksikpöördväärtuste teljestik: 1/V versus 1/[S] 1/V = (1/[S])(KM/Vmax) + 1/Vmax 2. Hanes: [S]/V versus [S] [S]/V = [S]/Vmax + KM/Vmax 3. Eadie-Hofstee: V versus V/[S] V = Vmax KM(V/[S]) Ensüümkineetika andmete analüüs Kui tulemuseks on sirge siis kehtib Michaelis Menteni võrrandile vastav kineetika Vmax ja KM on leitavad sirge parameetritest (tõus ja vabaliige)
saavutada aktiivtsentrite, ligandi seostamiskohtade vahel. Allosteerilised ensüümid: sigmoidsed V versus [S] kõverad Seda käitumist seletatakse kahe konformatsioonilise vormi esinemise kaudu: T-vorm (tense) madal afiinsus substraadi suhtes. Subühikut tähistatakse kastina R- vorm (relaxed) kõrge afiinsus substraadi suhtes. Sellises vormis subühik on ring Substraadil on kõrge afiinsus R-vormi suhtes ja seetõttu seostub eelistatult sellele. Lineveawer Burki graafikul pole mitte sirged, vaid on üleminek kahe sirge vahel ja need sirged vastavad R-vormis ja T-vormis olevale ensüümile (kui kõik ensüüm oleks ainult R- või T-vormis) Homoallosteeria teravdatud kontroll substraadi tasemel Substraat ise regulerib vms. Äärmuslikul juhul võimaldab homoallosteeria väga efektiivset kontrolli. Üleminek on hästi terav. Näeme, et substraadi konts saab akumuleeruda kuskile tasandile, siis terav üleminek ensüümi madalast aktiivsusest
annaabi.ee 
