praimerid teha 20 nukleotiidi pikkused. Sellisel juhul ongi nende sulamistemperatuur vajalikus vahemikus. 3. DNA süntees. Kui praimerid on amplifitseeritava DNA järjestuse kahelt poolt kindlaks teinud ja piiranud, sünteesib termostabiilne DNA polümeraas praimerite 3' otsast alates mõlemale DNA üksikahela fragmendile komplementaarse fragmendi, kasutades selleks segusse lisatud nukleotiide. Protseduur toimub 72 °C juures ning selleks kasutatakse termostabiilset Taq polümeraasi. Neid tsükleid korratakse 2030 korda, et amplifitseerida piisav arv DNA molekule. 45. Kuidas on polümeraasi ahelreaktsioon muutnud geenitehnoloogiat? PCR on muutnud DNA kloonimise muutnud palju kiiremaks ja lihtsamaks. PCR abil saab haiguste diagnostikat teha palju väiksema koguse DNA-ga. Üheks tähtsaks PCR-i kasutusalaks on võimaliku AIDS-i nakatumise diagnoosimine väga varajases staadiumis juba enne antikehade teket
Moodustab Endo söötmel tumepunaseid kuivi kolooniaid. 14. Nimeta vähemalt 3 substraati, milledel kasvades annab E. coli positiivse vastuse? Laktoos, β-D-glükuroniidid, briljantroheline, sapisoolad. 15. Kuidas käituda siis, kui E. coli tuvastamisel indooltest annab positiivse vastuse, kuid GUR aktiivsus puudub? gusA geen on defektne. 16. Miks peab PCR-il kasutama kahte praimerit? DNA-l on kaks ahelat. 17. Miks peab PCR-il kasutama termostabiilset DNA polümeraasi? DNA denatureeritakse 94-98 kraadi juures. Tavaline polümeraas denatureerub. 18. Miks valmistatakse elektroforeesi puhul geel puhvris, mitte tavalises vees? pH stabiilsuse tagamiseks, PCR toimub ainult kindlal pH-l. 19. Kuidas eristada DNA-fragmente geelelektroforeesil? Molekulid tuleb geelis nähtavaks tuua. Agaroosi kasutatakse maatriksina. 20. Miks voolutatakse geelelektroforeesil paralleelselt reeglina ka suurusmarkerit?
geelides või kapillaartorudes, fragmentide avastamiseks kasutatakse fototundlikke elemente. 45. Polümeraasi ahelreaktsioon. Polümeraasi ahelreaktsioon ehk PCR on meetod DNA või RNA järjestuse amplifikatsiooniks ehk kordistamiseks. PCR- meetod võimaldab väga väikesest DNA lõigust luua miljoneid koopiaid. PCR metoodika võimaldab in vitro paljundada konkreetset DNA fragmenti, kasutades selleks termostabiilset DNA polümeraasi. Polümeraas ahelreaktsioonil kasutatakse praimeritena tuntud järjestuse alusel sünteesitud oligonukleotiide, mis kinnituvad DNA erinevatele piirkondadele ning milled vahel sünteesitakse korduvalt samapikkuselisi DNA- lõike. Praimerid on alati paarikaupa, st seonduvad erinevate DNA- ahelatega. Esimeses tsüklis sünteesitakse lähtuvalt praimeritest nn pikad DNA- lõigud, mis ületavad teise vastaspraimeri seondumissaite
5. plasmiid viiakse bakterirakku, bakter kasvab ja plasmiid paljuneb 6. paljundatud geen isoleeritakse plasmiidist. 7. Milleks kasutatakse polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR), milliseid põhikomponente selleks vajatakse, millised on PCRi põhietapid? Kasutatakse uuritava DNA lõigu paljundamiseks in vitro.Geenide polümorfismi detekteerimine. Vajatakse: * kaks praimerit – peavad olema komplementaarsed uuritava DNA ahelate otstega * maatriks * termostabiilset Taq polümeraasi * vabu nukleotiide * puhvrit. Põhietapid: 1. DNA denaturatsioon üheahelaliseks (95 kraadi) 2. praimerite seondumine (50 kraadi) 3. DNA elongatsioon (72 kraadi). Tsükliline protsess – kokku 30 tsüklit. Uurimismaterjal: veri, karvad (karvasibul), sperma, limaskesta rakud, koeproov. 4. 8. Milleks kasutatakse kvantitatiivset polümeraasi ahelreaktsiooni (RT-PCR), milliseid põhikomponente selleks vajatakse, millised on RT-PCRi põhietapid?
Inimreservuaar normaalse floora osa seedekulglas: E. coli, Klebsiella etc. Loomreservuaar: enamus Salmonella nakkusi. Endogeenne levik vastuvõtlikul isikul ¨ võib lokaliseeruda suvalises organismi piirkonnas ¨ 5% hospitaliseeritud haigetel tekib haiglasisene nakkus, peamised põhjustajad Enterobacteriaceae nagu Escherichia coli, Kelbsiella jne. Inimene võib mõnikord olla asümptomaatiline kandja Salmonella, Salmonella typhi. Enterobakterite antigeenne struktuur 170 termostabiilset somaatilist O-antigeeni - oluline rakuseina Ag, termo-stabiilne; ¨ Spetsiifilised "O" antigeenid seotud kindla mikroobiliigiga, kuid ristreaktsioonid sageli: Salmonella ja Citrobacter; Escherichia ja Shigella. 50 termolabiilset viburite H-antigeeni n Rohkem kui 100 kapsulaarset K antigeeni. O, H ja K antigeenid ning patogeensus Teatud antigeenid seotud meningiidi, gastroenteriidi, kuseteede nakkustega. Samas Ag ja haiguse vaheline seos pole absoluutne. ¨ E. coli K1 sageli ka N
Shigella Punane (alus) Kollane (hape) Terve Must puudub Pseudomonas Punane (alus) Punane (alus) Terve Must puudub Lõplik samastamine toimub kas kommertsiaalse Vitek 2 süsteemi või MALDI-TOF abil (vt.üldosa praktikum); tüpiseerimiseks saadetakse isolaadid Eesti Tervisekaitse laboratooriumi. ENTEROPATOGEENSE E. coli VIRULENTSUSMARKERITE MÄÄRAMINE • ETEC – määratakse võime toota termostabiilset (ST) ja termolabiilset (LT) enterotoksiini, kasutades ELISA-t, lateksaglutinatsioonireaktsiooni või DNA teste • EPEC – määratakse O ja H antigeenne struktuur, otsitakse aglutinatsioonireaktsiooni abil teadaolevaid enteropatogeenseid serogruppe – O55, O111:H2 jt., kasutades selleks vastavaid polü- ja monovalentseid seerumeid • EIEC – invasioonivõime määramiseks HEp-2 ja HeLa rakukultuuridel, O ja H serotüpeerimine, ELISA
annaabi.ee 
