3. Teisena lisasin 0,2 ml E2 lahust (SDS lahustab bakteriraku mambraani fosfolipiidid ja denatureerib valgud, NaOH denatureerib DNA struktuurid) 4. Lahus muutus „tatiseks“. Pärast 5 min inkubeerimist laua peal lahus muutus selgemaks. 5. Nüüd pipeteerisin peale 0,2 ml E3 lahust (KAc peatab lüüsi ning normaliseerib pH, mille tagajärjel valgud ja gDNA välja sadenevad) 6. Lahuses ilmusid valged helbed, mida tuleb fuugida 10 min maksimumpööretel. 7. Tõstsin supernatanti uude epsi ning lisasin 0,42 ml (0,7 mahtu) isopropanooli. Jälle fuugimine 10 min jooksul. 57. Tuubid peab panema fuugi nii, et see väike korgi osa (ei tea kuidas seda eesti keeles seletada) vaatas meie poole, sest fuugimisel sade tekib just sellisel tuubi põhja poolel. Tekib pisike plasmiidse DNA sade, mille pealt eemaldasin supernatanti. 8. Pipeteerisin sademele 200 μl 70% EtOH, fuugisin 5 min jooksul, et vabaneda sooladest, ning
leukotsüütide esinemisel vedelikus. Piimjas, piimvalge või piimjalt häguse vedeliku esinemine viitab lümfisüsteemi osalusele efusiooni tekkes. Külotooraksi põhjuseks võib olla magistraallümfiteede vigastus (rindkeretrauma), maliigsed moodustised (lümfoom) või lümfiteede kasvajalised protsessid (lümfangioleiomüomatoos). Oluline on eristada külotooraksit empüeemist, selleks tuleb vedelik tsentrifuugida ning hinnata supernatanti. Mädase eksudaadi supernatant on selge ja läbipaistev. Roheline astsiidivedelik tekib sapi korral. Valdav osa pleura või kõhuõõne punktaate on helekollast värvust, rohkem või vähem läbipaistvad, niisugustel juhtudel selgitab vedeliku olemuse täpsem laboratoorne diagnostika.3 Transudaadi ja eksudaadi eristamine Nii astsiidi- kui pleuravedeliku puhul klassifitseeritakse antud efusioonivedelikke kas transudaadiks või eksudaadiks
renatureerub ja jääb lahusesse). Sega hoolikalt (nagu eelmises punktis). Hoia 2-3 min jääl. (5) Tsentrifuugi maksimaalsel kiirusel 5-6 min (sademeks on kromosomaalne DNA). Samal ajal pane valmis uus tuub, millesse pipeteeri 400 l propanooli (plasmiidse DNA & RNA sadestamiseks). (6) Eemalda supernatant (~900 l) ja kanna valmispandud tuubi. Sulge tuub ja sega intensiivselt (tekib plasmiidse DNA sade, RNA jääb osaliselt supernatanti). (7) Tsentrifuugi maksimaalsel kiirusel 8-10 min. Eemalda supernatant täielikult ja lahusta sade 100 l TE + Ribonukleaasi A (5 g/ml) lahuses (RNA lagundamiseks). Inkubeeri saadud lahust 37 oC juures ~30 min. Vt lisaülesanne 3.2. 1) suurem osa 1000 l pipetigakiirtsentrifuug 2) väiksema pipetiga eemaldasin ülejäänu supernatandi (8) Samal ajal valmista 1 x TBE 0,8% agaroosgeel DNA analüüsiks (grupi peale). Selleks on vaja 80 ml TBE puhvrit ja ... g agaroosi
Sega hoolikalt (nagu eelmises punktis). Hoia 2- 3 min jääl. Lahuse ülemises osas tekis valge sade. (5) Tsentrifuugi maksimaalsel kiirusel 5-6 min (sademeks on kromosomaalne DNA). Samal ajal pane valmis uus tuub, millesse pipeteeri 400 l propanooli (plasmiidse DNA & RNA sadestamiseks). (6) Eemalda supernatant (~900 l) ja kanna valmispandud tuubi. Sulge tuub ja sega intensiivselt (tekib plasmiidse DNA sade, RNA jääb osaliselt supernatanti). (7) Tsentrifuugi maksimaalsel kiirusel 8-10 min. Eemalda supernatant täielikult ja lahusta sade 100 l TE + Ribonukleaasi A (5 g/ml) lahuses (RNA lagundamiseks).Segame Vortexiga ja vuugime 1-2 minutit. Inkubeeri saadud lahust 37 oC juures ~30 min. Vt lisaülesanne 3.2. (8) Samal ajal valmista 1 x TBE 0,8% agaroosgeel DNA analüüsiks (grupi peale). Selleks on vaja 80 ml TBE puhvrit ja ... g agaroosi. Keeta mikrolaineahjus kuni agaroos on lahustunud.
täielikult lahustunud, ei lüüsu segu täielikult iii. E2 lahusega inkubeerimise aeg (kui inkubeerida liiga vähe, ei jõua rakud lüüsuda ning saagis jääb väike, kui aga liiga kaua, siis lisandub saagisele bakteri genoomseid järjestusi ning väheneb renatureeruva plasmiidse DNA kogus iv. hoolikus supernatandi eemaldamisel (tuleb eemaldada võimalikult suur kogus supernatanti, ilma, et sade kaasa tuleks, vastasel juhul kas kaotatakse osa saagisest, või võetakse kaasa jääke) 6. Kontroll-restriktsioon a. Kontroll-restriktsiooni on vaja, et kontrollida, kas saadud plasmiid on õige, see võimaldab ka näha, kas puhastamine oli efektiivne foreesipildilt on näha, kui proovis on lisaks saadud plasmiidile ka näiteks bakteriaalset DNA-d. Valides
Lisasin 1ml Amp-i sisalav vedelsööde Otsikuga katsusin valge kolooniat ja panin otsik epsi sisse Panin bakterid loksutavasse inkubaatorisse 16 tunniks kasvama 375 C juures 6.1 Praktikum – minipreparatsioon aluselise lüüsi meetodil Eesmärgiks on bakteris paljundatud plasmiidi välja puhastamine. Võtsin üleöö kasvanud bakterid ja fuugisin bakterid põhja Eemaldasin supernatanti Re-suspendeerisin pellet 0,2 ml-s E1 lahuses (50mM glükoos – teeb lahuse isotooniliseks, 25 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10nM EDTA-Na2 – seob katioone, inhibeerides ensüüme(DNAaasid) ja destabiliseerib raku membraani, RnaasA 10 µl/ml – eemaldab bakteriaale RNA prepsist). Lisasin 0,2 ml E2 lahus(0,2 N NaOH, 1% SDS – detergent, lõhustab bakteriraku membraani, denatureerib valku ja laseb aluse DNAd degradeerima
läbinud faagipartiklid radioaktiivselt märgistatud DNA-d ja valkudesse radioaktiivsust ei lülitunud. Viidi läbi 2 paralleelkatset: 1) 35S-ga märgistatud T2 partiklitega nakatati E. coli rakke mõne minuti vältel. Seejärel viidi nakatatud rakukultuur segistisse (blender) ning tsentrifuugiti rakud põhja. Enamus radioaktiivsusest jaotus rakupinnalt vabanenud faagi valkude koostises supernatanti. 2) 32P-ga märgistatud T2 partiklite puhul viidi läbi sama protseduur. Sel juhul jäi enamus radioaktiivsust pärast rakkude põhjatsentrifuugimist rakkudesse. Need katsed kinnitasid, et rakkudesse sisenes faagi T2 DNA, mitte aga valguline komponent. Tänapäevaks on välja töötatud meetodeid, mis võimaldavad rakkudesse viia eelnevalt puhastatud viiruse DNA-d. Vastavat protseduuri nimetatakse transfektsiooniks.
läbinud faagipartiklid radioaktiivselt märgistatud DNA-d ja valkudesse radioaktiivsust ei lülitunud. Viidi läbi 2 paralleelkatset: 1) 35S-ga märgistatud T2 partiklitega nakatati E. coli rakke mõne minuti vältel. Seejärel viidi nakatatud rakukultuur segistisse (blender) ning tsentrifuugiti rakud põhja. Enamus radioaktiivsusest jaotus rakupinnalt vabanenud faagi valkude koostises supernatanti. 2) 32P-ga märgistatud T2 partiklite puhul viidi läbi sama protseduur. Sel juhul jäi enamus radioaktiivsust pärast rakkude põhjatsentrifuugimist rakkudesse. Need katsed kinnitasid, et rakkudesse sisenes faagi T2 DNA, mitte aga valguline komponent. Tänapäevaks on välja töötatud meetodeid, mis võimaldavad rakkudesse viia eelnevalt puhastatud viiruse DNA-d. Vastavat protseduuri nimetatakse transfektsiooniks.
annaabi.ee 
