Intragenomic Profiling Using Multicopy Genes: The rDNA Internal Transcribed Spacer Sequences of the Freshwater Sponge Ephydatia fluviatilis Liisi Karlep, To~nu Reintamm, Merike Kelve* Department of Gene Technology, Tallinn University of Technology, Tallinn, Estonia Abstract Multicopy genes, like ribosomal RNA genes (rDNA), are widely used to describe and distinguish individuals. Despite concerted evolution that homogenizes a large number of rDNA gene copies, the presence of different gene variants within a genome has been reported. Characterization of an organism by defining every single variant of tens to thousands of rDNA repeat units present in a eukaryotic genome would be quite unreasonable. Here we provide an alternative approach for the characterization of a set of internal transcribed spacer sequences found within every rDNA repeat unit by implementing direct sequencing methodology. The promi...
5' (on vaja praimeri) 3' polümeraasne aktiivsus. 3' 5' eksonukleaasne aktiivsus (DNA parandamine) DNA sünteesil 5' 3' Tömbi otste Kasutatakse Kasutatakse eksonukleaasne saamiseks. peamiselt peamiselt PCR- aktiivsus 5' 3' sekveneerimisel. 3' reaktsioonides. 3' eksonukleaasne 5' eksonukleaasne 5' eksonukleaasne aktiivsus puudub. aktiivsus aktiivsus puudub. 4. Kirjelda järgnevate ensüümide funktsiooni: Pöördtranskriptaas:sünteesib DNA kasutades RNA ahelat Terminaalne deoksünukleotiid transferaas (TDT): Katalüüsib pöördumatu dNTP lisamine DNA 3' otsa hüdroksüül-rühma peale
haiguste diagnostikat teha palju väiksema koguse DNA-ga. Üheks tähtsaks PCR-i kasutusalaks on võimaliku AIDS-i nakatumise diagnoosimine väga varajases staadiumis juba enne antikehade teket. Tänu PCR-ile saab leukotsüütidest isoleeritud HIV nakkust tõestavat DNA fragmenti paljundada, kuni on saadud analüüsiks piisav kogus materjali. PCR-i kasutatatkse veel kliinilises meditsiinis, muteerunud geenide uurimisel, genoomide sekveneerimisel, haiguslike seisundite (DNA-viirused, RNA-viirused, hea- ning pahaloomulised kasvajad jne) uurimisel ning eristusdiagnoosi komplekteerimisel ja uute ravimite väljatöötamisel ning laboratoorsetel ning kliinilstel katsetel. 46. Milleks kasutatakse bioloogias tsentrifuugimist? Mikrotsentrifuuge kasutatakse väikeste koguste bioloogiliste molekulide või rakkude (prokarüootsete või eukarüootsete) eraldamiseks.
küljes on floresseeruv molekul, kui polümeraas teeb praimeri katki tekib värv. Floresentsi saab mõõta, ning näeme kui palju seda konkreetset DNA lõiku juurde tekib. (kvantitatiivne meetod, mõõdab hulka) Kuidas on polümeraasi ahelreaktsioon muutnud geenitehnoloogiat? PCR-meetod võimaldab väga väikesest DNA lõigust luua miljoneid koopiaid. Haiguste diagnostikas mängib olulist rolli, AIDS-i nakatumise diagnoosimine väga varajases staadiumis, muteerunud geenide uurimisel, genoomide sekveneerimisel, uute ravimite väljatöötamisel ning laboratoorsetel ning kliinilistel katsetel, kriminalistikas. Milleks kasutatakse bioloogias tsentrifuugimist? Kasutatakse väikeste koguste bioloogiliste molekulide eraldamiseks ja koostise uurimiseks. Tsentrifugaaljõudu kasutatakse bioloogiliste osakeste koostise uurimiseks. Selle abil saab eraldada nt. ribosoome, proteiine ja viirusi, samuti uurida rakumembraani kihte. Saab nt. kindlaks teha missugustest aminohapetest koosneb valk jne.
3. Uus konstrukt viiakse bakterirakkudesse. 45.DNA sekveneerimise põhimõte. DNA nukleotiidse järjestuse määramine.Põhineb DNA fragmentide populatsiooni analüüsil, kus kõik fragmendid algavad samast nukleotiidist, kuid lõppevad sellest statistiliselt erineval kaugusel.Korraga analüüsitakse nelja fragmentide segu, millest ühest lõppevad kõik fragmendid suvalisest G nukleotiidist, teises A nukleotiidist, kolmandas T ja neljandas C. DNA sekveneerimisel kasutatakse nii keemilist kui ensümaatilist meetodit.Keemiline põhineb keemilistel reaktsioonidel, mis võimaldavad DNA ahelat spetsiifiliselt katkestada kas A, G, C või C + T kohalt. See oli kasutusel DNA sekveneerimise algaastatel. Ensümaatilise meetodi töötas välja Sanger. Viiakse läbi DNA in vitro süntees, kus reaktsioonisegusse on lisatud DNA polümeraas, 4 erinevat desoksüribonukleotiidi ja 4 spetsiifilist
vektori DNA ahelate otsad ensüümiga DNA ligaas. Saadakse rekombinantsed DNA molekulid, mida on võimalik paljundada kas siis bakteri või eukarüoodi rakus. Tänu täiustunud tehnoloogiale, mis võimaldab üha kiiremini ja odavamalt määrata DNA nukleotiidset järjestust, on paeguseks sekveneeritud paljude organismide genoomi primaarjärjestus (nukleotiidne järjestus). Seisuga jaanuar 2004 (http://www.tigr.org) oli sekveneeritud 133 bakteri, 17 arhe ja 21 eukarüoodi genoom ning sekveneerimisel olevaid genoome on sadu. Seisuga aprill 2009 (vt. www.genomesonline.org) oli sekveneeritud 818 bakteri genoom, 104 eukarüoodi genoom ja 56 arhe genoom. 2497 bakteri genoomi ja 1029 eukarüoodi genoomi on sekveneerimisel. Genoomide sekveneerimine Inimese genoomi sekveneerimiseks käivitati teadusprojekt, kuhu kaasati laborid erinevatest riikidest. Töö koordineerimiseks loodi rahvusvaheline Inimese Genoomi Organisatsioon HUGO (Human Genome Organization)
vektori DNA ahelate otsad ensüümiga DNA ligaas. Saadakse rekombinantsed DNA molekulid, mida on võimalik paljundada kas siis bakteri või eukarüoodi rakus. Tänu täiustunud tehnoloogiale, mis võimaldab üha kiiremini ja odavamalt määrata DNA nukleotiidset järjestust, on paeguseks sekveneeritud paljude organismide genoomi primaarjärjestus (nukleotiidne järjestus). Seisuga jaanuar 2004 (http://www.tigr.org) oli sekveneeritud 133 bakteri, 17 arhe ja 21 eukarüoodi genoom ning sekveneerimisel olevaid genoome on sadu. Genoomide sekveneerimine Inimese genoomi sekveneerimiseks käivitati teadusprojekt, kuhu kaasati laborid erinevatest riikidest. Töö koordineerimiseks loodi rahvusvaheline Inimese Genoomi Organisatsioon HUGO (Human Genome Organization). Esimeseks projekti juhiks oli James Watson, kes koos Francis Crick'iga oli kirjeldanud DNA kaksikhelikaalse struktuuri. 1993-ndast aastast juhib projekti Francis Collins. Töö jaotati erinevate
kuumutamisel, keemilisel või ensümaatilisel meetodil. Prokarüootsete organismide, eriti bakterite puhul võib DNA vabastamiseks bakterirakku kuumutada üle 90°°C. PRAIMERI SEOSTUMINE (ANNEALING). Praimer on lühike nukleiinhappe lõik (oligonukleotiid pikkusega 20-30 nukleotiidi), mis vastavalt komplementaarsusele seostub (annealing) teatud kindla nukleiinhappe järjestusega. Igal mikroorganismi liigil, geenil, operonil on mingi unikaalne järjestus, mida on võimalik määrata sekveneerimisel, leida need andmed andmebaasidest (GENBANK jne.). Praimerid valitakse ja disainitakse nii, et nad asetseksid huvipakkuvast geenist või nukleotiidide järjestusest „väljaspool“ ja nende vahele jääks 50 kuni 1000 nukleotiidipaari. Kui praimerid panna koos denatureerunud sihtmärk-DNA-ga lahusesse, seostub üks praimer ahela ühele spetsiifilisele kohale (sait S1), samas kui teine ahela teisele kohale (sait S2). Praimerite seostumise protsess toimub temperatuuril ≥50º-58ºC.
annaabi.ee 
