erineval liikuvusel läbi peeneteralise võimalikult ühesuguse poorsusega geeli. Selle meetodi puhul kasutatakse pundunud geeligraanulitega täidetud kolonne. Geeli pooride mõõtmed on makromolekulide dimensioonidega samas suurusjärgus. Geelid, mida seda liiki kromatograafias kasutatakse koosnevad dekstraanist, agaroosist või polüakrüülamiidist. Mina tegin antud protseduuri kolonnis nr 2 ja geeliks oli Sefadex G-50. Geelkromatograafia kolonni iseloomustavad järgmised mahud: Täidise maht Vt Kolonni vaba maht, st graanilitevahelise medeliku maht Vv Graanilitesisese vedeliku maht Vs Geelimaterjali maht Vg Seega Vt= Vs+Vg Ainete segu juhtimisel läbi geelkromatograafia kolonni toimub molekulide lahutumine vastavalt nende võimele difundeeruda geeli pooridesse. Ainet iseloomustab elueerimismaht Vx. See on eluaadi maht, mis on kogutud aine maksimaalse kontsentratsiooniga fraktsiooni
erineval liikuvusel läbi peeneteralise võimalikult ühesuguse poorsusega geeli. Selle meetodi puhul kasutatakse pundunud geeligraanulitega täidetud kolonne. Geeli pooride mõõtmed on makromolekulide dimensioonidega samas suurusjärgus. Geelid, mida seda liiki kromatograafias kasutatakse koosnevad dekstraanist, agaroosist või polüakrüülamiidist. Mina tegin antud protseduuri kolonnis mis sisaldas geeli Sefadex G-75. Geelkromatograafia kolonni iseloomustavad järgmised mahud: Täidise maht Vt Kolonni vaba maht, st graanulitevahelise vedeliku maht Vv Graanulitesisese vedeliku maht Vs Geelimaterjali maht Vg Vt= Vs+Vg Ainete segu juhtimisel läbi geelkromatograafia kolonni toimub molekulide lahutumine vastavalt nende võimele difundeeruda geeli pooridesse. Ainet iseloomustab elueerimismaht Vx. See on eluaadi maht, mis on kogutud aine maksimaalse kontsentratsiooniga fraktsiooni
h = 31,5 cm Geeli maht: Vt = Sp*h = r2*h = *(1,1)2*31,5 =119,68 cm3 k = 0,1 Vg = k*Vt = 0,1*119,68 = 11,9 cm3 Vxmax = Vt Vg = 119,68 11,9 = 107,7 cm3 Fraktsioonide teoreetiline arv: n = Vxmax/2 =107,7/2 = 53 Kogusin kolonni väljavooluavast tilkuva eluaadi koonilisse kolvi ning hiljem mõõtsin ära vedeliku mahu: Vv = 34 ml Uuritav segu koosneb kolmest komponendist: dekstraansinine, müoglobiin ja DNA- aspartaat, elueerimispuhvriks oli pH=7,5 0,05M Tris/HCl. Kolonn sisaldab: Sefadex G-50 Lainepikkus Fraktsiooni Eluaadi Optiline (nm) nr maht (ml) tihedus 1 36 0,037 2 38 0,169 670 3 40 0,248 4 42 0,189 5 44 0,095 6 46 0,039 6 46 0,692 7 48 0,849
väljuvad nad kolonnist esimesena, st neil on minimaalne elueerimismaht V xmin, mis võrdub kolonni vaba mahuga. Vxmin = Vv Ained, mille molekulid on piisavalt väiksed, et mahtuda täielikult geeli pooridesse väljumad maksimaalse elueerimismahuga Vxmax, mis on ligilähedane kolonni kogumahule Vxmax Vt . Kromatografeerimise võib lugeda lõpetatuks, kui kolonni läbinud vedelikku maht ületab kolonni kogumahtu. Töö käik. Kolonni tätmine ja iseloomustamine Geel: Sefadex 6-50 Täidetud kolonnile arvutatakse geelisamba kõrguse ja diameetri alusel täidise kogumaht Vt Geelisamba kõrgus = 31cm Sissediameeter = 2,0 cm Vt = r2h = 3,14*12*31= 97,34 cm3 Vastavalt kolonni täitematerjalli iseloomustava teguri k väärtusele leitakse geelimatriksi maht Vg k = 0.1 Vg = k*Vt = 0,1* 97,37 = 9,734 cm3 Geelimatriksi mahust lähtuvalt leiame antud kolonnile iseloomulik maksimaalne elueerimismaht Vxmax Vxmax =Vt-Vg = 97.37 9,734 = 87,6= 88 cm3
molekulmassiga ainete erineval liikuvusel läbi peeneteralise, võimalikult ühesuguse poorsusega geeli. Selle meetodi puhul kasutatakse pundunud geeligraanulitega täidetud kolonne ja geeli pooride mõõtmed on makromolekulide dimensioonidega samas suurusjärgus. Ainete segu juhtimisel läbi geelkromatograafia kolonni toimub molekulide lahutumine vastavalt nende võimele difundeeruda geeli pooridesse, s.t. vastavalt molekuli suurusele. Antud kolonn sisaldas Sefadex G75 geeli. Geelkromatograafia kolonni iseloomustavad järgmised suurused: · Täidise maht ( Vt) · Kolonni vaba maht ehk graanulitevahelise vedeliku maht (Vv) · Graanulitesisese vedeliku maht (Vs) · Geelimaterjali ( maatriksi) maht (Vg) Vt=Vv+Vs+Vg Ainet iseloomustavad: Elueerimismaht ehk väljumismaht Vx. Ehk siis eluaadi maht, mis on kogutud kuni aine maksimaalse kontsentratsiooniga fraktsiooni kolonnist väljumiseni.
Elueerimine lõpeteti kui väljus viimane värviline komponent ja eluaat muutus värvituks. Fraktsioone analüüsiti spektromeetritel neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel, milles järeldub lahuse optiline tihedus. Täiesti värvusetute fraktsioonide optilise tiheduse väärtused võrduvad 0-ga ja neid fraktsioone polnud vaja mõõta. Tulemused esitati kromatogrammina. TULEMUSED JA NENDE INTERPRETATSIOON Täidise mark SEFADEX G-75 Pundumistegur k 0,1 Täidise kõrgus L 31,5 cm Kolonni sisediameeter d 1,8 Täidise kogumaht ( ) Geelmaatriksi maht Maksimaalne elueerimismaht Fraktsioonide üldarv Dekstraansinine Uuritav segu Müoglobiin DNP-aspartaat
· Vxmax- maksimaalne elueerimismaht, eluaadi maht, mille juures väljuvad need molekulid, mis on võimelised graanulitesse täielikult sisenema Kui aine molekulid mahuvad geeli pooridesse, siis iseloomustatakse nende liikumist kolonnis liikuvus-teguriga Rf, mille väärtus jääb vahemikku 0...1. Rf= (Vx-Vxmin)/(Vxmax-Vxmin) Aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vahelist graafilist sõltuvust nim. kromatogrammiks. Töö käik Kolonni iseloomustavad suurused Kasutatav geel Sefadex G-75 Pundumistegur k=0,1 Geelisamba kõrgus L= 29,5 cm Kolonni sisediameeter 2,1 cm ( r= 1,05 cm) Vajalikud arvutused tööks Kogumaht Vt= Sp * L Sp= r2 Vt= 3,14 * (1,05)2 * 29,5 = 102 cm3 Geelimaatriksi maht Vg= k* Vt Vg= 0,1* 102 = 10,2 cm³ Maksimaalne elueerimismaht Vxmax= Vt-Vg Vxmax= 102-10,2= 91,8 cm3 Fraktsioonide üldarv n= Vxmax/ 2 n= 91,8/246 katseklaasi Elueerimispuhver: 0,15 M NaCl; 20 mM Tris/HCl; pH= 7,5
annaabi.ee 
