lõhub rakumembraani ja alus saab seonduda plasmiidse DNAga, mis seejärel denatureerub. Aluselises keskkonnas rakud lüüsuvad ja DNA denatureerub. Segada õrnalt. Lahus 3 sisaldab KOAc (kaaliumoksaalatsetaat). See neutraliseerib lahust ja lubab plasmiidse DNA renatureerimise ja KOAc aitab sadestada detergendi (SDS). Kuna viiruse genoom on väiksem, siis renatureerub ta kiiremini kui bakteri 4Mb suurune kromosoom. Kromosoom ei jõua kaheahelaliseks minna. 10. Miks RNA töötlus? RNaasi töötlus aitab veelgi puhtamaks saada puhastatavat DNA lahust. RNaas lagundab RNA rakkudes. 11. Millist tüüpi restriktaase kasutame? tüüp 2 - lõike- ja seondumissait kattuvad. Lõikavad vaid dsDNA-d (ainult ds lineariseerub, ss jääb tsirkulaarseks - tsirkulaarne jookseb geelil kiiremini - saab neid eristada). Tunneb ära 6-nukleotiidilise järjestuse GAATTC. Vajab tööks Mg ++. Lõigatud otsad jäävad üheahelaliseks (aka. kleepuvad otsad). 12
Vt lisaülesanne 3.2. (8) Samal ajal valmista 1 x TBE 0,8% agaroosgeel DNA analüüsiks (grupi peale). Selleks on vaja 80 ml TBE puhvrit ja ... g agaroosi. Keeta mikrolaineahjus kuni agaroos on lahustunud. Jahutada vesivannis ja lisada DNA nähtavaks tegemiseks 1 l EtBr (5 g/l). Valada geel vormi, kuhu on varem valmis pandud nn ,,kamm" või ,,hambad". ~30 min pärast on geel tardunud. Punkt 9 jääb vahele. (9) Peale 30 min inkubatsiooni teosta DNA-le fenooltöötlus. See on vajalik RNaasi eemaldamiseks. Selleks: - lisa RNaasA-ga töödeldud DNA-le võrdses koguses fenooli (100 l) (tõmbe all!!!) - tsentrifuugi 1-2 min - kanna vesikiht uude tuubi (~100 l). Vesikihis on DNA ning valgud (RNaas) jäävad fenoolkihti ja vahekihti - DNA sadestamiseks lisa vesikihile 1/20 osa (5 l) NaOAc ja 3 mahtu (300 l) 95% etanooli - sega korralikult läbi - tsentrifuugi maksimaalsel kiirusel 8-10 min - eemalda supernatant
Selleks on vaja 80 ml TBE puhvrit ja ... g agaroosi. Keeta mikrolaineahjus kuni agaroos on lahustunud. Jahutada vesivannis ja lisada DNA nähtavaks tegemiseks 1 l EtBr (5 g/l). Valada geel vormi, kuhu on varem valmis pandud nn ,,kamm" või ,,hambad". ~30 min pärast on geel tardunud. 8 (9) Peale 30 min inkubatsiooni teosta DNA-le fenooltöötlus. See on vajalik RNaasi eemaldamiseks. Selleks: - lisa RNaasA-ga töödeldud DNA-le võrdses koguses fenooli (100 l) (tõmbe all!!!) - tsentrifuugi 1-2 min - kanna vesikiht uude tuubi (~100 l). Vesikihis on DNA ning valgud (RNaas) jäävad fenoolkihti ja vahekihti - DNA sadestamiseks lisa vesikihile 1/20 osa (5 l) NaOAc ja 3 mahtu (300 l) 95% etanooli - sega korralikult läbi - tsentrifuugi maksimaalsel kiirusel 8-10 min - eemalda supernatant
takistab viiruse DNA/RNA paljundamist. Samuti takistab kasvajate kasvu. Viirusega nakatunud rakk vabastab viiruseosakesi, mis saavad naabruses olevaid rakke nakatada. Nakatunud rakk hoiatab teisi vabastades samal ajal ka inteferoone. Teised rakud toodavad vastusena intederoonile suurtes kogustes ensüümi proteiinkinaas R, see on fosforüleerimisvõimega, seondub transkriptsioonifaktoritele, nii et ei saa rakus toimuda proteiinisüntees. Toodetakse ka RNaasi, mis lagundab rakusisest RNA-d. Samuti toodetakse mitmeid teisi proteiine, mis põhjustavad nakatunud rakkude apoptoosi. Samuti suurendatakse MHC I ekspressiooni – nii et viraalsed peptiidid esitatakse tsütotoksilistele T rakkudele. Ka MHC II ekspressiooni – suurendab viiruspeptiidide esitamist helper T rakkudele, mis omakorda vabastavad tsütokiine (sh veel inteferoone). Inteferoon-gamma suudab otseselt aktiveerida immunrakke: nt makrofaage ja NK rakke.
nad ribosoomidega tihedalt kaetud ja seetõttu kaitstud RNaaside toime eest. Degradatsiooniradade suhtes esineb komplementatsioon. Kui rakk on defektne ühe degradatsiooniraja suhtes, võib mRNA degradatsioon toimuda ka teise degradatsiooniraja kaudu, nii et silmatorkavat efekti mRNA stabiilsusele ei pruugi alati ilmneda. Kui ka komplementeeriv degradatsioonirada on defektne, on see rakkudele letaalne. Ensüümid, mis osalevad mRNA degradatsioonil Bakterites on kirjeldatud üle 20 RNaasi, mis osalevad tRNA-de ja rRNA protsessingul. Mõned neist osalevad ka mRNA degradatsioonil. Vastavalt sellele, kas nad lõikavad RNA molekulide sisemistesse järjestustesse, lõhkudes fosfodiestersidemeid või lagundavad RNA molekule otsast, jaotatakse RNaase endo- ja eksoribonukleaasideks. Eksoribonukleaasid Erinevalt eukarüootidest on bakteritel kirjeldatud ainult 3' 5' suunas mRNA-d lagundavaid eksoribonukleaase
Pre-RC – pre-replikatsiooni kompleks, mis koosneb ORC-dest. Moodustab selle 6 eri polüpeptiidist. Eukarüootide replikatsiooni lõpetamine on seotud terminatsioonisaidiga – järjestus on polaarne. Mõlema ahela jaoks on oma terminatsiooni koht. Kui saadakse omavahel seondunud ahel, siis üleliigne DNA lagundatakse. Juhtiv ahel sünteesib lõpuni välja komplementaarse ahela. Teise ahela puhul vajatakse RNA praimerit, mis jääb sinna külge. See on omakorda vaja eemaldada Rnaasi poolt – jääb üheahelaline replitseerimata DNA. See koht kromosoomi lõpus tuleb siiski replitseerida. Looduse üks lahendus on telomeraas, mis toimib vaid eukarüootides. 74 Telomeerid sisaldavad paljusid kordusi ja erinevatel rakkudel on eri arv kordusi. Üheahelalise otsaga seondub RNA, polümeeri otsa lisatakse 3 nukleotiidi, pikendatakse teist ahelat. Toimub telomeraasi translokatsioon. Liigub edasi, kuni tema
annaabi.ee 
