mille tõttu ekspresseerus GFP erinevates rakupiirkondades. PEI polüetüleenimiin pakib DNA kokku ja interakteerub membraaniga ja difundeerub läbi membraani. 3. Millised elemendid peavad olema eukarüootses ekspressioonivektoris? Loomarakkudele mõeldud ekspressioonivektor (plasmiid) sisaldab: 1.komponente, mis võimaldavad plasmiidi bakteris paljundada (prokarüootset replikatsiooni alguspunkti, antibiootikumi resistentsusgeeni); 2.kloneerimisala (MCS) erinevate restriktaaside lõikekohad; 3.uuritavat järjestust (valkude korral tavaliselt cDNA kujul); 4.reportergeeni (GFP, lutsiferaas, lacZ jt.) või märgise (tag; FLAG, myc, V5, GFP) järjestust. 5.eukarüootset promootorit (CMV, SV40) ja polüadenüleerimisjärjestust (SV40); 6.selektsioonimarkeri ekspressioonikassetti. Praktiline töö III Immuunotsütokeemia 1. Mille poolest on erinevad monoklonaalsed ja polüklonaalsed antikehad?
· S-M, susceptible negative control; · GAPDH Glütseraaldehüüd-3-Fosfaat Dehüdrogenaas 3.5. SNARE geenide up-regulation leherooste nakkuse ajal nisus · Paremaks arusaamiseks SNARE geenide funktsioonist mRNA tasemel, ruumilised ja ajalised expression patterns võrreldi ja contrasted in mock- and pathogen-inoculated tundliku ja resistantse nisu NILs. · qRT-PCR based geen expression uuringud avaldasid SNARE koopia potentsiaalse rolli incompatible (resistentsusgeeni varjav taim vs. virulentne patogeen) leherooste koostoimete ajal. · Kui HD2329 + Lr28 rida oli nakatatud leherooste patogeeniga, relative to the HD2329 isoliin ja mock-inoculated controls,täheldati kõigi kolme SNARE geeni väljendi kasvu ( Fig. 7). · Sobimatu koostoime ajal, oli väljend indutseeritud 12 hpi-lt onwards kõigile kolmele SNARE geenile (Fig. 7). · Maksimaalne väljendperiood 24 ja 48 hpi-l vastasid proliferatsiooni perioodile ja
12.Mitokondriaalsete haiguste kõrvaldamine 13.DNA ja valkude eraldamine, forees 14.DNA ja valkude hübridiseerimine, ülekanne 15.Transposoonide ehitus, koostis transposoon (ingl. Transposon)- DNA-element, mis võib liikuda (transponeeruda) DNA-molekuli ühest osast teise või eri DNA- molekulide vahel. Tn9 koosneb kahest samasuunalisest IS1-elemendist, mis ümbritsevad klooramfenikooli resistentsusgeeni (camr). Tn5 koosneb kahest erisuunalisest IS50-elemendist (L ja R), mis ümbritsevad kanamütsiini-, bleomütsiini- ja streptomütsiiini resistentsusgeene (kanr, bler, strr). Tn10 koosneb kahest erisuunalisest IS10-elemendist (L ja R), mis ümbritsevad tetratsükliini resistentsusgeeni (tetr). bp, nukleotiidipaari. 16. Transposoonide tüübid 1. Transponeeruvad elemendid a
õnnestunud. Geeli analüüsil selgus, et inserdi kontsentratsioon oli umbes 13,7 ng/l. Kuna vektori ja inserdi pikkuste suhe 3851/330=11,7. Kuna vektorit oli 9 ng, saame leida vektori ja inserdi koguste suhte: (13,7*11,7)/9=17,70. See suhe on küllaltki sobiv. 3. Rekombinantse plasmiidi ligeerimine a) Kasutasime pSTBlue-1 vektorit, mis sisaldab kahte replikatsiooniks vajalikku origini (üks kummaski suunas), ampitsilliini ja kanamütsiini resistentsusgeeni ja lacZ operoni, mille lugemisraami sisestame oma inserdi. See võimaldab sini-valge meetodil välja selgitada, millistes kolooniates on tühi, millistes meie inserti sisaldav plasmiid. Vektoril on T-overhangidega otsad, mis võimaldab A-overhangidega inserti sisestada. b) PCR-i produkti on võimalik vektorisse ligeerida, kuna vektoril on T-overhang otsad ning PCR-i produktil on A-overhang otsad. T ja A on omavahel komplementaarsed,
meetodid (nt. kaltsiumfosfaat, katioonsed polümeerid, dendrimeerid, liposoomid ja katioonsed lipiidid) ja füüsikalised meetodid (nt. elektroporatsioon, sono-poratsioon, optiline transfektsioon, magnetogektsioon, mikroinjektsioon). 121. Loomarakkudele mõeldud plasmiid sisaldab: komponente, mis võimaldavad plasmiidi bakteris paljundada (originit ning antibiootikumi resistentsusgeeni) kloneerimisala (MCS) – paljude erinevate restriktaaside lõikekohad uuritavat järjestust (valkude korral tavaliselt cDNA kujul) reportergeeni (GFP, lacZ jt.) või märgise (FLAG, myc, V5, GFP) järjestust eukarüootset promootorit ja polüadenüleerimisjärjestust selektsioonimarkeri ekspressioonikassetti 122. 123. pEGFP : võimaldab ekspresseerida EGFP-d (roheliselt fluorestseeruv valk) eukarüootsetes rakkudes
mikroinjektsioon). Meie majas on kasutusel ka Amaxa Nucleofector –aparaat, mis kombineerib elektroporatsiooni ja keemilisi transfekteerimise meetodeid. Võimaldab efektiivsemalt transfekteerida rakke, mis muude meetoditega hästi ei taha transfekteeruda. Loomarakkudele mõeldud plasmiid sisaldab: • komponente, mis võimaldavad plasmiidi bakteris paljundada (origini- prokarüootset replikatsiooni alguspunkt, antibiootikumi resistentsusgeeni) • kloneerimisala (MCS) – sisaldab paljude erinevate restriktaaside lõikekohti • uuritavat järjestust (valkude korral tavaliselt cDNA kujul) • eukarüootset promootorit (CMV, SV40) ja polüadenüleerimisjärjestust(SV40) Sageli ka: • reportergeeni (GFP, lacZ jt.) järjestus • märgise järjestus(FLAG, myc, V5, GFP) • selektsioonimarkeri ekspressioonikasset Praktikumis on kasutusel pEGFP (enhanced green flourescent protein)
annaabi.ee 
