Hoiavad koos vesiniksidemed ja disulfiidsidemed. Osad valgud jäävad pikkadeks ribadeks, ei moodusta geoobulit (kera). neljanda järgu struktuur: mitu valgu molekuli moodustavad koos suure geoobuli. (nt. vere valk hemoglobiin koosneb 4st valgu molekulist. Denaturatsioon kõrgemate järkude struktuuride kadumine (kuni 2 kadumiseni). Tugev hape, raputamine, kiirgus: 4st 3ks. muna vahustamine, keetmine Renatureerub taastab esialgse kuju, kui mõjud on olnud nõrgad.
Suspendeeritakse puhvris, sest vees võib DNA laguneda. Lahus 2 sisaldab SDS ja NaOH. Aluseline töötlus, mille käigus detergent SDS lõhub rakumembraani ja alus saab seonduda plasmiidse DNAga, mis seejärel denatureerub. Aluselises keskkonnas rakud lüüsuvad ja DNA denatureerub. Segada õrnalt. Lahus 3 sisaldab KOAc (kaaliumoksaalatsetaat). See neutraliseerib lahust ja lubab plasmiidse DNA renatureerimise ja KOAc aitab sadestada detergendi (SDS). Kuna viiruse genoom on väiksem, siis renatureerub ta kiiremini kui bakteri 4Mb suurune kromosoom. Kromosoom ei jõua kaheahelaliseks minna. 10. Miks RNA töötlus? RNaasi töötlus aitab veelgi puhtamaks saada puhastatavat DNA lahust. RNaas lagundab RNA rakkudes. 11. Millist tüüpi restriktaase kasutame? tüüp 2 - lõike- ja seondumissait kattuvad. Lõikavad vaid dsDNA-d (ainult ds lineariseerub, ss jääb tsirkulaarseks - tsirkulaarne jookseb geelil kiiremini - saab neid eristada). Tunneb ära 6-nukleotiidilise järjestuse GAATTC
ja suspendeeri bakterimass 200 l Lahuses I. Sega hoolikalt (vortex), et tekiks ühtlane suspensioon. Kasuta vajadusel pipetti. (3) Lisa 400 l lahust II (rakud lüüsuvad, valgud ja nukleiinhapped denatureeritakse), ning sega ettevaatlikult "end-over-end" stiilis (segajat mitte kasutada, see lõhub kromosomaalset DNA-d, mis võib sel juhul hiljem kaasa sadeneda!). Aseta tuub mõneks minutiks jääle. (4) Lisa 300 l jääkülma lahust III (valgud ja kromosomaalne DNA sadenevad välja, plasmiid renatureerub ja jääb lahusesse). Sega hoolikalt (nagu eelmises punktis). Hoia 2-3 min jääl. (5) Tsentrifuugi maksimaalsel kiirusel 5-6 min (sademeks on kromosomaalne DNA). Samal ajal pane valmis uus tuub, millesse pipeteeri 400 l propanooli (plasmiidse DNA & RNA sadestamiseks). (6) Eemalda supernatant (~900 l) ja kanna valmispandud tuubi. Sulge tuub ja sega intensiivselt (tekib plasmiidse DNA sade, RNA jääb osaliselt supernatanti). (7) Tsentrifuugi maksimaalsel kiirusel 8-10 min
(3) Lisa 400 l lahust II (rakud lüüsuvad, valgud ja nukleiinhapped denatureeritakse), ning sega ettevaatlikult "end-over-end" stiilis (segajat mitte kasutada, see lõhub kromosomaalset DNA-d, mis võib sel juhul hiljem kaasa sadeneda!). Aseta tuub mõneks minutiks jääle. (4) Lisa 300 l jääkülma lahust III (valgud ja kromosomaalne DNA sadenevad välja, plasmiid renatureerub ja jääb lahusesse). Sega hoolikalt (nagu eelmises punktis). Hoia 2- 3 min jääl. Lahuse ülemises osas tekis valge sade. (5) Tsentrifuugi maksimaalsel kiirusel 5-6 min (sademeks on kromosomaalne DNA). Samal ajal pane valmis uus tuub, millesse pipeteeri 400 l propanooli (plasmiidse DNA & RNA sadestamiseks). (6) Eemalda supernatant (~900 l) ja kanna valmispandud tuubi. Sulge tuub ja sega intensiivselt (tekib
mullikesteks e.mitsellideks) bakteriraku membraani fosfolipiidid ning denatureerib valgud. Naatriumhüdroksiid aga denatureerib DNA struktuurid. Lahus muutub"tatiseks" 6. Inkubeeri laua peal 3 minutit. Selle aja jooksul muutub lahus selgemaks. Juhul, kui inkubeerida üle 5 minuti, saad saagise hulka bakteri genoomseid järjestusi ning vähenab plasmiidse DNA hulk, mis korrektselt järgmises etapis renatureerub (puhastamise saagis väheneb!). 7. Pipeteeri peale 0,3 ml E3 lahust ja raputa segu kuni see on täiest ühtlane. Peaksid nägema helbeid, mitte valkjaid triipe lahuses. 8. Tsentrifuugi 10 min maksimumpööretel toatemperatuuril (RT) eppendorfi põhja tekkis purune sade, vähesel määral oli valgeid helbeid ka lahuse pinnal. 9. Tõsta supernatant uude epsi ning lisa sinna 0,5 ml (0,7 mahtu) isopropanooli
membraani, denatureerib valku ja laseb aluse DNAd degradeerima. Kuna plasmiidne DNA on tsirkulaarne, siis ahelad ei eralduvad), suspendeerisin. Inkubeerin laua peal 5 minutit. Lisasin peale 0,2 ml E3 lahus(5 M KOAc – peatab lüüsi, mille tagajärjel valgud ja genoomne DNA sadenevad välja. Reageerib SDS-da, tekitades ka mittelahustava sadet. 10% äädikhape pH normaliseerimine. Plasmiid DNA renatureerub ja asub nüüd supernatandis, ulejäänud – sade.) ja raputasin kuni see täesti ühtlane Tsentrifuugisin 10 min maksiumpööretel toatemperatuuril, ning tõstin supernatandi uude epsi Uue epsi lisasin 0,42 ml isopropanooli ja segasin hoolikalt (alkohooli ja soola lisamine varjab DNA negatiivsed laengud ja nüüd DNA sadeneb välja)
struktuuri teket enne kui valk on oma sihtkohta viidud. Väiksemate valkude ruumiline 7 struktuur tekib iseenesest sünteesi käigus ja ei vaja lisafaktoreid (ruumilise struktuuri tekkeks vajalik info valgu primaarstruktuuris). Ribunukleaas A (RNaas A) – denatureerida (kuumutamise, keemiliste ainetega), jääb primaarstruktuur muutumatuks, lagunevad vaid nõrgad sidemed, mis ruumilist struktuuri kinni hoidsid. Renatureerub kui on sobivad kofaktorid – valgu ligandid, mis stabiliseerivad tema struktuuri. Nt metalli ioonid (moodustavad valgu struktuuris koordinatiivseid sidemeid). Renatureerimist kiirendavad ensüümid – valgu disulfiidi isomeraas, peptidüül-prolüül isomeraasid – kiirendavad disulfiidsidemete vahetust või proliini konformatsiooni muutust. Kiirendavad ka chaperonid. Chaperonid erinevad funktsioonid – toimivad valgusünteesi käigus, osalevad valgu
annaabi.ee 
