Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine Teooria Proteolüütilised ensüümid ehk proteaasid on ensüümid, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi reaktsiooni valkudes ja peptiidides, produtseerides madalama molekulmassiga peptiide ja vabu aminohappeid. Protreolüütiliste ensüümide esindajad omavad erinevat toimespetsiifikat. Mõned lõhustavad eelistatult spetsiifilisi, vaid teatud aminohapetega külgnevaid peptiidsidemeid, teised toimivad kõikidele peptiidsidemetele. Samas paljud bakteriaalsed proteaasid omavad väga nõrka spetsiifikat ja lagundavad valkudes praktiliselt kõiki peptiidsidemeid produtseerides vabu aminohappeid. Sõltuvalt sellest, kas proteaas toimib polüpeptiidahela kesksetele või otsmistele sidemetele eristatakse endo- ja eksopeptidaase. Lisaks eristatakse proteaase veel optimaalse keskkonna pH järgi, kas hapudeks-, neutraalseteks- või leelisproteaasideks. Oluliseks proteaaside klassifikatsiooni aspektiks on...
Tiitrimiseks kulunud vasksulfaadi lahuse hulga järgi leitakse taandavate suhkrute kontsentratsioon (kaliibrimissirgelt). Töö käik Kasutati tahket invertaasi, mida kaaluti 0,01g ja millele lisati 5ml atsetaatpuhvrit, mille pH=4,8. Seda segati klaaspulgaga 5 minutit. 50ml katseklaasi pipeteeriti 25ml 7%-list sahharoosilahust atsetaatpuhvris (pH=4,8) ja katseklaas asetati vesitermostaati 30-kraadi juurde 10ks minutiks. Samal ajal valmistati ette kolm 250ml koonilist kolbi, pipeteerides sinna 10ml komplekslahust. Kui substraat termostaadis 10 minutit oli olnud, võeti see välja, lisati sellele 1ml invertaasi töölahust, loksutati katseklaasi, fikseeriti ensüümireaktsiooni algusaeg, võeti sealt kuiva pipetiga 1ml lahust ja asetati katseklaasi tagasi termostaati. Pipett tühjendati esimesse komplekslahusega kolbi. See oli 0-proov. 10 minuti pärast võeti sama pipetiga 1ml reaktsioonisegu ja viidi teise kolbi, katseklaas asetati
spektrofotomeetiliselt hõlpsasti detekteeritavad. Saadakse kätte türosiini sisaldus erinevatel aegadel võetud proovidest. Töö käik Alkalaasi preparaadist valmistati boraatpuhvris, mille pH=8,4, lahus, lisades 0,01g alkalaasile 5ml boraatpuhvrit. Lahust segati klaaspulgaga kuni alkalaas lahustus. 50ml katseklaasi pipeteeriti 25ml 2%-list kaseiini lahust ja asetati vesitermostaati 30-kraadi juurde 10 minutiks. Samal ajal valmistati ette 4 katseklaasi, pipeteerides igaühte 3ml TKÄ lahust (5%). Pärast kaseiini soojendamist pipeteeriti kaseiinile juurde 1ml valmistatud alkalaasi töölahust, segu loksutati kiiresti läbi, fikseeriti aeg, võeti kuiva pipetiga 3ml reaktsioonisegu ja asetati katseklaas tagasi termostaati. 3ml reaktsioonisegu pipetis viidi esimesse TKÄ-d sisaldavasse katseklaasi, see oli 0-prooviks. Edasi võeti iga viie minuti järel reaktsioonisegu termostaadist, et võtta sealt 3ml segu ja viia
= 430 nm ja =550 nm. Seejärel leida uuritavas lahuses Mn ja Cr kontsentratsioonid valemi järgi: A430 ja A550- vastavad uuritava lahuse neelduvused 430 ja 550- Mn standardlahuste neeldumistegurite keskmised '430 ja '550- Cr standardlahuste neeldumistegurite keskmised l- küveti paksus, cm A-lahuse neelduvus mõõdetava lainepikkuse juures C- lahuse molaarne kontsentratsioon l- küveti paksus Töö käik: 1. Valmistasin standardlahused: Mn standardlahuse 0,05 mg/ml valmistasin pipeteerides 9,1 ml 0,1 N KMnO4 lahust 200 ml mõõtkolbi ja lisades sellele dest. vett. Sellest pipeteerisin 5,0, 7,0 ja 9,0 ml mõõtkolbidesse ja lisasin dest. vett. Cr 1 mg/ml lahust pipeteerisin 1,5, 3,0 ja 4,0 ml mõõtkolbidesse ja lisasin dest. vett. 2. Mõõtsin kõikide lahuste (kaasaarvatud uuritav lahus) neelduvused ja läbilaskvused spektrofotomeetril lainepikkustel 430 ja 550 nm. Tulemused: Aine Kolvi 430 nm 550 nm (430) (550) Konts.
valmistatakse seeria kindla kontsentratsiooniga lahjendusi. Selleks kantakse teatud kogus (näiteks 1 ml) uuritavat proovi steriilse pipetiga kindlasse kogusesse (tavaliselt 9 ml) steriliseeritud lahjendusvedelikku. Lahjendustest, millest eeldatakse mõnekümne (soovitavalt 20 30) kuni saja koloonia väljakasvamist (antud söötmel kasvamisvõimeliste mikroorganismide orienteeruv sisaldus kuni mõnisada rakku milliliitris) tehakse külvid Petri tassidele, pipeteerides steriilse pipetiga kindla koguse (enamasti 0.1 kuni 0.5 ml suurem vedelikukogus ei imendu geeli) lahust agari pinnale ning ajades selle steriilse drigalski spaatli abil ühtlaselt mööda söötme pinda laiali. Sügavkülv võimaldab hinnata (aeroobsete) mikroorganismide arvukust ning uurida nii pindmiste kui ka söötmesiseste kolooniate kuju ja suurust. Uuritavast proovist valmistatakse vajalikud lahjendused analoogiliselt eelmises punktis kirjeldatule.
15ml falkon tuub 2,4 ÷ 0,2=12 1,5 ml tuubid PCR plaadi tükk Töö käik: Teen 15-ml falkon tuubi 5,5ml 30% homogeenset pesuvahendilahust Võtan kaks 1,5ml- tuubi ning pipeteerin mõlemasse 1,55ml lahust. Pipeteerin alles jäänud lahuse 200µl kaupa PCR plaadi aukudesse. Tulemus: Sain 7,5 auku täidetud, kuigi oleks pidanud jätkuma 12 tuubi jaoks. Viga tuli sellest, et detergenti pipeteerides jäid sisse õhumullid, mida tegelikkuses ei oleks tohtinud seal olla. II HARJUTUS Eesmärk: Õppida silma järgi hindama pipeteeritava koguse mahtu. Materjalid: Erinevate veekogustega tuubulid Töö käik: Esimeses tuubulis on 200µl Hinnata silmaga, mis kogused on järgnevates tuubulites. Tulemused: Minu arvatud Tegelik 200 µl
Harjutus 2 Hindasin silmaga vee koguseid: 1. 200 l 2. 60 l 3. 100 l 4. 20 l 5. 7 l 6. 90 l 7. 40 l 8. 150 l Hinnangud polnud küll päris täpsed, aga siiski küllaltki lähedased. Harjutus 3 Pipeteerisin laual oleva plaadi viide auku 100 l broomfenoolsinist, lisasin vastavalt 50 l, 5 l, 1 l ja 0,5 l. Lisaks lisasin juhendist erinevalt ühte auku 20 l, ning pipeteerisin uue puhta broomfenoolsinise kuuendasse auku. Tulemuseks oli küllaltki sujuv värvirida. Blotipaberile oma nime ja mustrit pipeteerides jälgisin, et pipett ei läheks liiga sügavale lahusesse, et pipett oleks otse ning pipeteerimine toimuks sujuvalt, et kogused oleks võimalikult täpsed ning täpid tuleksid ühtlased. 1. Polümeraasi ahelreaktsiooni teostamine a) Paljundamiseks sain plasmiidi pEGFP-FoxO3a-wt, praimeritest kasutasin: · EGFP-3-s-170-F (5'-CATGGTCCTGCTGGAGTTCGTG-3') · SV40p-R (5'-GAAATTTGTGATGCTATTGC-3')
annaabi.ee 
