Külmas säilitatuna on reagent väga stabiilne (1 aasta). 2. 1 M NaOH lahus, kasutatakse juhul, kui valk pole lahustuv värvaine lahuses. 3. Tee standardvalgu (BSA) lahjenduste rida: 1 mg/ml 0,5 mg/ml 0,2 mg/ml 0,1 mg/ml 0,05 mg/ml 4. Terve grupi peale on antud 5x Bradfordi reagendi stock. Lahjenda see 25 ml-s, et oleks 1x stock. 25 ml kohta lisa 100 µl 5M NaOH. Lahustina kasuta mQ vett. 5. Pipeteeri igasse eppendorfi 1,5 ml 1x Bradfordi reagenti ning lisa 50 µl BSA valgulahust erineva kontsentratsiooniga. Viimasesse eppendorfi pipeteeri samuti 1,5 ml 1x Bradfordi reagenti ning lisa 50 µl uuritava valgulahust tundmatu kontsentratsiooniga. Sega korralikult. Lase reaktsioonil toimida 10 minutit. Sellel ajal seadista spektrofotomeetrit. 6. Iga grupi peale on 1 spektrofotomeeter, milles on 578 nm või 546 nm filter. Kõigepealt lülita sisse seade (AusEin)
(gradueeritud katseklaas). 6. Lisa väike kogus puhverlahust ja sega klaaspulgaga minutit kuni alkalaasi lahustumiseni. NB! Selget lahust ei teki, sest preparaadid sisaldava täiteainet! Samas suured klimbid peavad olema kadunud! 7. Täida klaas puhverlahusega etteantud mahuni ja loksuta läbi, et ensüümi kontsentratsioon lahuses ühtlustuks. ENSÜÜMREAKTSIOONI (KASEIINI HÜDROLÜÜSI) LÄBIVIIMINE: 1. Võta 50 ml mahuga suur katseklaas. a) Pipeteeri 25 ml 2%-list kaseiini lahust. (Kaseiin on substraadiks) NB! pH peab olema reguleeritud ensüümile sobiva väärtusega! b) Kata klaas korgiga ja aseta vesitermostaati 30°C juures 5-10 minutiks soojenema. 2. Võta 4 kuiva normaalmõõdus (20 ml) katseklaasi. Nummerda katseklaasid! 3. Pipeteeri igaühte 3 ml 5%-list TKÄ lahust. 4. Kui kaseiini lahus on temperatuurini 30°C soojenenud, alusta elnsüümreaktsiooniga- KASEIINI HÜDROLÜÜSIGA! NB
Ole hoolas: lahusesse jäävad klämbud ei lüüsu järgmises etapis täielikult ja seega saad vähem plasmiidi. Glükoos muudab E1 lahuse isotooniliseks, EDTA seob kahevalentsed katioone (seega inhibeerib paljusid ensüüme, kes töötamiseks neid enda koostisse vajavad) ja Tris on puhverdav reagent. RNAas A eemaldab bakteraalse RNA prepsist(ehk prepareeritavast plasmiidsest DNAst) 5. Lisa 0,2ml E2 lahust ning pipeteeri mitu korda edasi-tagasi. E2-s sisalduv SDS solubiliseerib (lahustab pisikesteks puhvris ujuvateks mullikesteks e.mitsellideks) bakteriraku membraani fosfolipiidid ning denatureerib valgud. Naatriumhüdroksiid aga denatureerib DNA struktuurid. Lahus muutub"tatiseks" 6. Inkubeeri laua peal 3 minutit. Selle aja jooksul muutub lahus selgemaks. Juhul, kui inkubeerida üle 5 minuti, saad saagise hulka bakteri genoomseid
Töö käik · Õppejõult saadi prooviks sidrunimahl · Sidrunimahlast tehti 20x lahjendus ja filtriti · Valmistati 1mg/ml glükoosilahsest kaliibrimislahus glükoosi sisaldusega 0,25mg/ml ning sellest kaks lahjendust konsentratsioonidega 0,125mg/ml ja 0,062mg/ml · Seati valmis ja nummerdati 6 puhast katseklaasi · Katseklaasi o Nr 1 pipeteeriti 1ml destileeritud vett o Nr 2 ja 3 pipeteeriti 1ml uuritavat lahust o Nr 4,5 ja 6 pipeteeri igasse 1ml erineva konsentratsiooniga glükoosilahust. · Igasse katseklaasi pipeteeriti 3ml eelnevalt valmistatud tööreaktiivi* ja loksutati · Katseklaase hoiti 20 minutit toatemperatuuril · Spetrofotomeertia põhimõttel mõõdeti optilised tihedused katseklaasides *Õppejõu poolt valmistatud 25ml tööreaktiiv koosnes: · 2,5mg glükoosi oksüdaasi · 1,5mg peroksüdaasi · 16,6ml 0,2M fosfaatpuhvrit, pH = 6,0
(1) Kahe üliõpilase peale restrikteerida ~120 ng genoomset DNA-d Cfr42I-ga: 12,5 l genoomset DNA-d + 1,5 l restriktaasi 10 x puhvrit kokku 15 l; segada, fuugida ja inkubeerida 37oC 60 min + 1 l restriktaasi Cfr42I (jääl) (2) Peata restriktsioon kuumutades 65 oC 20 min (restriktaas inaktiveerub). Tsentrifuugi, et eemaldada kaanelt kondenseerunud veeaur ja seejärel sega lahuse ühtlustamiseks. (3) Ligeerimisreaktsiooniks pipeteeri järgmisi komponente sellises järjekorras (teostab iga üliõpilane): 3 l restrikteeritud genoomset DNA-d + 1 l Cfr42I restrikteeritud pBS SK+ plasmiidi (10 ng) (teostatud juhendaja poolt) + 1 l 5 x ligeerimispuhvrit kokku 6 l + 1 l (5 ühikut) T4 DNA ligaasi (jääl) Selleks, et toimuks konkatemeersete DNA struktuuride moodustumine, peab [DNA] > 5 ng/l. (4) Inkubeeri toatemperatuuril kuni 24 h
12,5 l genoomset DNA-d + 1,5 l restriktaasi 10 x puhvrit kokku 15 l; segada( segame Vortexiga), fuugida ja inkubeerida 37oC 60 min + 1 l restriktaasi Cfr42I (jääl) (restriktaasi 10x puhver tähendab seda, et lahuse kontsentratsioon on 10 korda suurem ,kui vaja on.) (2) Peata restriktsioon kuumutades 65 oC 20 min (restriktaas inaktiveerub). Tsentrifuugi, et eemaldada kaanelt kondenseerunud veeaur ja seejärel sega lahuse ühtlustamiseks. (3) Ligeerimisreaktsiooniks pipeteeri järgmisi komponente sellises järjekorras (teostab iga üliõpilane): Ligeerimine kahe nukleiinhape molekuli kokku kleepumine, kasutades fermenti DNA-ligaas. 3 l restrikteeritud genoomset DNA-d + 1 l Cfr42I restrikteeritud pBS SK+ plasmiidi (10 ng) (teostatud juhendaja poolt) + 1 l 5 x ligeerimispuhvrit kokku 6 l + 1 l (5 ühikut) T4 DNA ligaasi (jääl)
annaabi.ee 
