Võib olla nii, et muidu hüdrofoobse piirkonna sisse tekkib kanal. Läbi selle kanali saavad liikuda hüdriilsed ained. Valgu molekulid tagavad niisiis iga konkreetse membraani spetsiifilisuse. KLONEERIMINE 15/10/09 Restriktaasid on ühed valgulised ensüümid, sellised ensüümid, mis lõikavad katki DNA'd. Nukleiin happeid lagundavad üldiselt sellised ensüümid nagu nukleaasid. Rakkudes on palju erinevaid nukleaase, mis lõhuvad fosfodiestersidemeid. RNA'd lõhub ribonukleaas ja DNA'd desoksüribonukleaas ja on olemas ebaspetsiifilisi nukleaase, mis lõhuvad nii RNA, kui ka DNA ahelaid. Kõikidel tuntud nukleaasidel oli üks ühine omadus: nad lõhkusid fosfodiestersidemeid järjestusest sõltumata. Seetõttu ei olnud võimalik katki lõigata spetsiifilisi lõike. Kuuekümnendate aastate lõpus Smith, Johns Hopkins (???) avastasid bakterirakkudest veel ühed desoksüribonukleaasid, mis erinesid
mis voimaldab maaratleda geenide NH-lise koostise, nende tapse asukoha kromosoomis, aga ka geeni poolt kodeeritavate valkude aminohappelise koostise. Insenergeneetika -geenide DNA jarjestuse muutmine ja muudetud geenide voi uute geenide viimine rakkudesse ja organismi. Organismide geneetiline modifitseerimine. Restriktsiooni-ehk piiravad ensuumid 1970. a. avastati, et paljudel bakteritel on omadus lohustada bakterirakku tunginud voorast DNA-d (peamiselt bakterviiruseid) fragmentideks. Ensuume e nukleaase, mille abil viiruste DNA lohkumine toimus hakati nimetama restriktsiooniensuumideks, kuna nad olid maaravaks teguriks sellise nahtuse puhul nagu peremehepoolne bakterviiruste infitseerivuse piiramine (ingl.k. host restriction). Restriktsiooni nukleaasidel ehk restriktaasidel on omadus loigata DNA topeltahel labi kindlas piirkonnas (loikepiirkond-ingl. k. restriction site), mille maarab ara antud piirkonna DNA NH-jarjestus (aratundmisjarjestused; ingl. k. recognition sequenceskoosnevad 4-8
b. Rakkude tihedus plaadil oli umbes 50%, kuna plaadi suurus jäi samaks, tuli 10% tiheduse saavutamiseks plaadile alles jätta 1/5 rakususpensioonist. Kokku oli 1200 l suspensiooni, seega plaadile jäi 240 l ning eemaldasin 960 l. 11. a. Lüüsipuhvri valmistamiseks pipeteerisin 15 ml tuubi Tris-HCl (hoiab puhvri pH sobivana), NaCl, Triton-X 100 (detergent, mis lõhub membraanstruktuurid, see vabastab valgud rakusisemusest ja organellidest), glütserooli, EDTA (inhibeerib nukleaase, mis muidu lagundaksid valgud) ning vett. Segasin ning hoidsin puhvrit jääl. b. Sellist valgulüsaati kasutatakse tavaliselt edasi immuunosadestamiseks, Western blotiks või ELISA analüüsiks. Need meetodid võimaldavad uurida rakkude valgulist koostist või eraldada spetsiifilist valku ülejäänud raku komponentidest. 12. a. Kasutasime keemilist meetodit. Selleks lahjendasime DMEM-is eraldi DNA ja PEI ning seejärel segasime lahused kokku. DEI moodustab DNA-ga kompleksid
lüsaati ning selleks võtame neid pipetiga uue epsi. 4. Lisada 4 ml-ni söödet (seega 3,4 ml), teha 8-kujulisi liigutusi ning asetada tass CO2 inkubaatorisse. 94. 95.Rakkudest lüsaadi valmistamine 96. Eesmärgiks on tutvustada erinevaid võimalusi rakkude lüüsimiseks valkude, RNA või DNA edasiseks analüüsiks. 97. Genoomse DNA eraldamine imetajarakkudest 98. Rakud lüüsitakse puhvris, mis sisaldab SDS-i (lahustab rakumembraanid), NaCl, EDTA-d (inhibeerib nukleaase) ja proteinaas K-d (lagundab valgud) pidevalt segades 37°C või 55°C juured. DNA sadestatakse isopropanooliga, mille tulemusena tekkib lahusesse DNA pundar, mille saab otsiku abil tõsta puhtasse tuubi. DNA lahustamiseks kasutatakse enamasti Tris-HCl puhvrit EDTA-ga. 99. DNAd saab edasi kasutada genotüüpiseerimiseks, mingite lõikude amplifitseerimiseks, kloneerimiseks jne. 100. 101. RNA eraldamine imetajarakkudest 102
Meie hinnatud rakkude tihedus on 20%, seega tassile peab jääma 600 μl rakususpensiooni. Ülearustest rakkudest (600 μl) tehakse lüsaati, seega tõstsin rakud pipetiga uue epsi. Lisasin 3,4 ml söödet, tegin 8-kujulisi liigutusi ning panin tass CO2 inkubaatorisse. 3. Praktikum - rakkudest lüsaadi valmistamine (2014): Genoomse DNA eraldamine imetajarakkudest Rakud lüüsitakse puhvris, mis sisaldab SDS-i (lahustab rakumembraanid), NaCl, EDTA-d (inhibeerib nukleaase) ja proteinaas K-d (lagundab valgud) pidevalt segades 37°C või 55°C juures. DNA sadestatakse isopropanooliga või etanooliga, mille tulemusena tekkib lahusesse DNA pundar, mille saab otsiku abil tõsta puhtasse tuubi. DNA lahustamiseks kasutatakse enamasti Tris-HCl puhvrit EDTA-ga. DNAd saab edasi kasutada genotüüpiseerimiseks, mingite lõikude amplifitseerimiseks, kloneerimiseks jne. RNA eraldamine imetajarakkudest
vältimiseks? 85. Iseloomustage apoptoosi etappe Apoptoosi alguses toimub raku kokkutõmbumine, kromatiin pakitakse kokku ja viiakse tuumamembraani äärealadele (püknoos), tsütoplasma kondenseerub. Seejärel tuum mureneb (karüoreksis) ja rakk fragmenteerub surnud rakuks ja apoptootilisteks osakesteks. Lõpuks fagotsüüt teeb pacmani. Alternatiivne variant sama seletamiseks :): 1. aktiveeritakse kaspaasid 2. kromatiin kondenseerub (pakitakse kokku), aktiveeritakse nukleaase (kromatiin lagundatakse fragmentideks), tuum fragmenteerub 3. tsütoplasma kondenseerub, raku membraani muutused markeerivad apoptootilise raku fagotsüütidele (rakk laguneb vesiikuliteks) 86. Iseloomustage kaspaase ja kaspaaside kaskaadi kaspaas - (spetsiifilised proteaasid) apoptoosile iseloomulikud valke lagundavad ensüümid. Aktiivtsentris asub tsüsteiin. Peptiidsidemed lagundatakse Asp jäägi kohalt. Kaspaase on palju - esmalt aktiveeritakse prokaspaas, mis oma korda aktiveerib
poolt kodeeritavate valkude aminohappelise koostise. 5) Insenergeneetika- geenide DNA järjestuse muutmine ja muudetud geenide vôi uute geenide viimine rakkudesse ja organismi. Organismide geneetiline modifitseerimine. Restriktsiooni- ehk piiravad ensüümid 1970. a avastati, et paljudel bakteritel on omadus lõhustada bakterirakku tunginud võõrast DNA-d (peamiselt bakterviiruseid) fragmentideks. Ensüüme e nukleaase, mille abil viiruste DNA lõhkumine toimus hakati nimetama restriktsiooniensüümideks, kuna nad olid määravaks teguriks sellise nähtuse puhul nagu peremehepoolne bakterviiruste infitsee- rivuse piiramine (ingl.k. host restriction). Restriktsiooni nukleaasidel ehk restriktaasidel on omadus lõigata DNA topeltahel läbi kindlas piirkonnas (lõikepiirkond - ingl. k. restriction site), mille määrab ära antud piir- konna DNA NH-järjestus (äratundmisjärjestused; ingl. k
annaabi.ee 
