need elus kus on tertatsükliini resistentsus. Aga need ei ole meie bakterid. Mis juhtuks, kui unustaksime lisada X-gali? Kas viga oleks saanud parandada? Milleks X-gali on vaja? 11 Kui me ei oleks X-gali lisanud, siis ei oleks tekkinud sini-valget värvuseid. Me ei oleks saanud kuidagi enda bakterikoloonaid eristada. Viga saaks parandada hõõrudes X-galiga tassi. Praktiline töö nr. 7: Minipreparatsioon aluselise lüüsi meetodil Eesmärk: Bakterites paljundatud plasmiidi välja puhastamine Materjalid: 1,5 ml LB vedelsööde Kasvatame baktereid vedelsöötmes, et neid aereerida. Sisaldab ka antibiootikumi. Valge bakterikoloonia 200 µl Lahus E1 Hoiab rakke elus.
Kui rakkude kompetetnsus on 106, siis kui palju tuleks DNA-d transformeerida, et plaadil näha 100 kolooniat? Kui 100 ng plasmiidi transformatsiooni tulemusel kasvab plaadil 1000 kolooniat, siis milline on rakkude kompetentsus? Kui rakkude kompetentsus on 106, siis tuleks 0,1 ng DNA-d transformeerida, et plaadil näha 100 kolooniat. Kui 100 ng plasmiidi transformatsiooni tulemusel kasvab plaadil 1000 kolooniat, siis rakkude kompetentsus on 104. Töö nr 3: Rekombinantse plasmiidse DNA minipreparatsioon. Lähteained: Bakterikoloonia (sisaldab rekombinantset plasmiidi) kasvatatud Amp-LB vedel-söötmel 12-20 h (nn. ,,over night" ehk ON kultuur). Meie rühmas oli kolooniate arv väike, st transformatsiooni efektiivsus oli madal. Rakud olid säilitusel kaotanud kompetentsuse. Lahus I (50 mM glükoos, 25 mM Tris-HCl, pH 8,0; 10 mM EDTA- Na2) Lahus II (0,1 N NaOH*, 1% SDS; * erineb sellest, mis on toodud DNA kokaraamatus; 0,1 N lahuse
Kui rakkude kompetetnsus on 106, siis kui palju tuleks DNA-d transformeerida, et plaadil näha 100 kolooniat? Kui 100 ng plasmiidi transformatsiooni tulemusel kasvab plaadil 1000 kolooniat, siis milline on rakkude kompetentsus? Kui rakkude kompetetnsus on 106, siis tuleks 0,1 ng DNA-d transformeerida, et plaadil näha 100 kolooniat. Kui 100 ng plasmiidi transformatsiooni tulemusel kasvab plaadil 1000 kolooniat, siis rakkude kompetentsus on 104. Töö nr 3: Rekombinantse plasmiidse DNA minipreparatsioon. Lähteained: Bakterikoloonia Nr.6 (sisaldab rekombinantset plasmiidi) kasvatatud Amp-LB vedel-söötmel 12-20 h (nn. ,,over night" ehk ON kultuur). Lahus I (50 mM glükoos, 25 mM Tris-HCl, pH 8,0; 10 mM EDTA- Na2) Lahus II (0,1 N NaOH*, 1% SDS; * erineb sellest, mis on toodud DNA kokaraamatus; 0,1 N lahuse kasutamine 0,2 N asemel tõstab oluliselt DNA saagist ning võimaldab eraldada maksimaalse koguse superspiraalset plasmiidi vormi K. Mätlik ja M. Speek, avaldamata andmed)
Saadud sooja homogeense söötme valasime õhukese kihina Petri tassidele ning jätsime tarduma. Antibiootikumina kasutasime ampitsilliini, kuna transformeeritavas plasmiidis on ampitsilliini resistentsusgeen, mis võimaldab rakkudel, milles transformeerimine on õnnestunud, kasvama ja paljunema hakata. Oleks saanud kasutada ka kanamütsiini, kuna plasmiidis on ka kanamütsiini resistentsusgeen, kuid ampitsilliini kasutamine on vähem komplitseeritud. 5. DNA minipreparatsioon: a. Bakterikoloonia on bakterite kogum, mis tekib ühe bakteriraku paljunemisel. b. Petri tassil oli 25 kolooniat, neist 4 valged. Vedelsöötmesse panin kasvama ühe valge koloonia, kuna koloonia valge värv näitab, et nendes rakkudes on plasmiid, milles lacZ operoni lugemisraam on inserdi poolt rikutud vastasel korral sünteesitaks rakkudes dikloro-dibromo-indigod ning kolooniad oleks sinised. c. Minipreparatsiooni protokoll:
Bakterikoloonia on üks bakter ja suur arv tema koopiaid. 8. Enne järgmist praktikumi tuleb panna saadud valged kolooniad kasvama. Selleks kasutasin eppendorfi, mille korgi sisse torkasin õhuaugu. Valasin 1 ml vedelsöödet (840 μl LB söödet), mis sisaldab 160 μl Amp-i (algne konts. 100 mg/ml) ning pipeti otsiku abil lisasin baktereid minu kolooniast (ühest, tähistasin seda Peetri tassil). Asetasin tuubid kasvama 37 °C inkubaatorisse. 53. 54. Minipreparatsioon aluselise lüüsi meetodil 55. Eesmärgiks on bakteris paljundatud plasmiidi välja puhastamine. Selleks kasutatakse erinevaid lahuseid, mis muutuvad pH-d ja mille lisamise tagajärjel paljud fragmendid, mis saastavad plasmiidse DNA, tekitavad sadet ning neid on lihtne eraldada. 56. Aluselise lüüsi meetodil on tähtis see, et pH muutmisel bakteri genoomne DNA denatureerub kuid plasmiidse DNA ahelad jäävad seotuna teineteisega. Kui muuta pH esialgseks väärtuseks,
Sinised kolooniad sisaldasid plasmiidi, vaid ei sisaldanud inserdi, aga valged sisaldasid õige plasmiidi. Valisin kõige suurema valge koloonia ja panin neid kasvama: Võtsin epsi, kus tegin augu (ilma hapnikuta bakretid suervad ära) Lisasin 1ml Amp-i sisalav vedelsööde Otsikuga katsusin valge kolooniat ja panin otsik epsi sisse Panin bakterid loksutavasse inkubaatorisse 16 tunniks kasvama 375 C juures 6.1 Praktikum – minipreparatsioon aluselise lüüsi meetodil Eesmärgiks on bakteris paljundatud plasmiidi välja puhastamine. Võtsin üleöö kasvanud bakterid ja fuugisin bakterid põhja Eemaldasin supernatanti Re-suspendeerisin pellet 0,2 ml-s E1 lahuses (50mM glükoos – teeb lahuse isotooniliseks, 25 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10nM EDTA-Na2 – seob katioone, inhibeerides ensüüme(DNAaasid) ja destabiliseerib raku membraani, RnaasA 10 µl/ml
annaabi.ee 
