vahemaade taha. Embrüosiirdamine inimesel: Alguses: · Kehavälise viljastamise metoodika puudulikkus · Laialdane eetiline vastuseis Kasutatakse sel juhul, kui: · Naise tavapärasel viisil rasestumist takistab mingi terviserike. · Meestel esinevad viljakushäired. 1.in vitro meetod: · Embrüo viibiv katseklaasis 2-5 päeva. · Spermid ja munarakud on katseklaasis kokku viidud · Embrüo areneb beebiks ema kõhus 2.in vitro meetod · Mikroinjektsioon-sperm süstitakse mikropipeti abil otse munarakku · Arenevat embrüot kasvatatakse söötmel moorula või blastotsüsti staadiumini ja siirdatakse seejärel naise emakasse. · Embrüosiirdamine inimesel: 1.Etapp-munarakk võetakse otse munasarjast 2.Etapp-kontrollitakse munarakku 3.Etapp-munarakk koos spermiga viiakse söötmesse. 4.Etapp-valitakse välja viljastunud munarakud 5.Etapp-sügoodid kantakse kasvusöötmesse 6
külmutamist, sulatamist üle umbes 50% külmutatud embrüotest ja kõiki selle põhjuseid ei teata. Ainult tugevamad jäävad ellu. - Mingil määral näib see loomade piinamisena leebemal viisil. - Looduse vastu töötamine või nagu mehaaniline kaasa aitamine. 2. In vitro viljastamiseks kasutatakse kaht varianti. 1) Spermid ja munarakud on katseklaasis kokku viidud 2) Mikroinjektsioon sperm süstitakse mikropipeti abil otse munarakku. Mina eelistaksin esimest varianti kuna selle protsessi käigus valitakse välja paremini arenenud embrüod, siis on suurem võimalus positiivsele tulemusele. 3. 1) In vitro viljastamise metoodika puudulikkus 2) Laialdane eetiline vastasseis peeti ebaloomulikuks sellist sigimisviisi ja seetõttu inimesele sobimatuks. Paljud usuringkonnad peavad seda inimelu
munajuha * eetiline vastuseis umbus) * Mehel vähe seepe või permide liikuvus on puudulik Kehavälise viljastumise embrüosiirdamise etapid inimesel: Viljastumine „invitro“ jaguneb kaheks: *Spermid ja munarakud katseklaasis kokku * Mikroinjektsioon (sperm süstitakse munarakku) Munarakud munajuhas või munasarjas. Kasutatakse ultrahelikuva abil spetsiaalset nõelpipetti. Munarakke kontrollitakse, puuetega rakud kontrollitakse. Munarakud + permid sobivale söötmele jäetakse üleöö +37 kraadi juurde. Need viljastunud munarakud, mis sisaldavad kahte tuuma, valitakse välja. Sügoot kasvusöötmesse. 2-5 päeva pärast valitakse välja normaalselt arenenud moorula või blastotsüsti staadiumis
Alguses takistasid kaks asjaolu: 1.kehavälise (in vitro) viljastamise metoodika puudulikkus 2.laialdane eetiline vastuseis. Embrüosiirdamist kasutatakse juhul, kui: 1.naise tavalisel viisil rasestumist takistab mingi terviserike(munajuhade või emaka limaskesta kahjustused) 2.meestel esinevad viljakushäired (seemnerakkude arvu ja kvaliteedi muutused) Viljastamiseks in vitro kasutatakse kahte meetodit: 1. spermid ja munarakud viiakse katseklaasis kokku mikroinjektsioon- sperm süstitakse mikropipeti abil otse munarakku. Arenevat embrüot kasvatatakse söötmel. Embrüosiirdamise etapid inimesel: 1. munarakud võetakse nõelpipetiga otse munasarjast. 2. munarakud kontrollitakse, puuetega rakud kõrvaldatakse. 3. munarakud koos spermiga viiakse söötmesse. 4. valitakse välja viljastunud munarakud, mis sisaldavad pronukleust (munaraku ja spermi ühinemiseelsed tuumad) mõni kord tuleb kasutada mikroinjektsiooni. 5. sügoodid kantakse kasvusöötmesse. 6
Füüsikalised meetodid. · elektroporatsioon rakule tehakse elektrisokk, mille tulemusel tekivad membraani väikesed avad ja DNA siseneb rakku. Tapab osa rakke maha. · sono-poratsioon ultraheliga · optiline transfektsioon laseriga tehakse raku membraani auk, kasulik üksikute rakkude uurimiseks. · pommitamine kullaosakestega (geenipüss) · magnetofektsioon DNA seotakse magnetiseeruvate nanoosakestega ja magnetvälja mõjul sisestatakse rakku. · Mikroinjektsioon DNA süstitakse otse üksikutesse rakkudesse, transgeensete loomade tegemisel kasutatakse 2. Mis on GFP, milliseid konkreetseid ekspresioonikonstrukte praktikumis kasutati? GFP-green fluoroescent protein, GFP võib funktsioneerida kui proteiin tag, ta viiakse plasmiidse DNA sees rakku ning tänu temale seotud signaaljärjestusele, saab sisseviidud DNA-valk kompleks seostuda just spetsiifilisse kohta rakus, ning tänu fluoroessents-
mikroorganisme suudab metaboliseerida. a) Protokatehuaadiks b) Bensoaadiks c) Fenooliks d) Katehooliks e) Tolueeniks 4. Valige järgnevast loetelust kaks põhilist meetodit võõr DNA sisestamiseks taimerakku transgeensete taimede saamiseks? a) Agroinfektsioon Agrobacterium tumefaciens-i abil b) Laser vahendatud geeniülekanne c) Liposoom vahendatud geeniülekanne d) DNA mikroinjektsioon taimerakkudesse e) Biolistika (geenipüss) 5. Kui võrrelda taimekasvatuses kasutatavaid putukatõrjevahendeid, siis milliste insektitsiidide toimespekter on kitsam võimaldades rakendada täpselt suunatud kahjuritõrjet teatud kindlate putukaröövikute vastu? a) Bioloogilisi insektitsiide b) Keemilisi insektitsiide 6. Tööstusliku fermentatsiooni puhul kasvatatakse bioprodukte põhiliselt perioodilises ehk batch kultuuris
Seerumit,(Kinnitus maatriksit (ECM kinnituseks) koosneb kollageenist, hüaluroon happest ja teistest ECM valkudest). Osad võivad kasvada ka 3D geelis ja suspensioonis. · Mida nimetatakse transfektsiooniks, milliseid alternatiivseid meetodeid saab kasutada? Transfektsioon on võõra DNA viimine rakku. Keemilised meetodid. Kaltsiumfosfaadi meetod, DEAE dekstraan Füüsikalised meetodid. Mikroinjektsioon ja elektroporatsioon Membraanide fusioonid. Liposoomid, katioonsed lipiidid ja DNA kompleks lipofektsioon (DNA) konstrukti sisestamine viiruste abil. DNA viirused= näit. SV 40 (simian virus) pôhinevad vektorid · Mis on GFP, milliseid konkreetseid ekspresioonikonstrukte praktikumis kasutati? GFP-green fluoroescent protein, GFP võib funktsioneerida kui proteiin tag, ta viiakse plasmiidse DNA sees rakku ning tänu temale seotud signaaljärjestusele, saab
51.Mobiilsed geenid e. transposoonid- genoomi ühest osast teise liikuvad lõigud. 52.Transformatsioon- geneetilise informatsiooni ülekandumine ühest bakterirakust teise rakust isoleeritud DNA abil. Võib toimuda ka looduslikes tingimustes. Sel juhul kandub elusrakkudesse surnud rakkudest vabanenud DNA. Transduktsioon- faagide poolt vahendatud geneetilise informatsiooni ülekanne ühest bakterirakust teise. 53. Geenide otsese ülekande meetodid: *süstlaga rakku süstimine-mikroinjektsioon *biolistika-raku "tulistamine" raskmetallidega *elektroporatsioon 54.Geenide ülekanne vektorite abil: Vektorid on vahendajad. Nende abil saab organisme geneetiliselt muundada.(Uus geen või selle product võib muuta org.ainevahetust, mille tulemusena võib tekkida kahjulikke aineid). nt bakterite plasmiidid- need võtavad võõrast DNAd keskkonnast kergesti sisse. Sellised plastiidid on agrobacteriumites. 55. Agrobacterium`i liigid kui vektorid geenide ülekandel taimedel:
viimine loomarakku. Plasmiidi sisseviimiseks peavad rakud ennast hästi tundma ja paraja tihedusega olema (reeglina 50-70%). 120. Transfekteerimiseks kasutatakse erinevaid võimalusi: keemilised meetodid (nt. kaltsiumfosfaat, katioonsed polümeerid, dendrimeerid, liposoomid ja katioonsed lipiidid) ja füüsikalised meetodid (nt. elektroporatsioon, sono-poratsioon, optiline transfektsioon, magnetogektsioon, mikroinjektsioon). 121. Loomarakkudele mõeldud plasmiid sisaldab: komponente, mis võimaldavad plasmiidi bakteris paljundada (originit ning antibiootikumi resistentsusgeeni) kloneerimisala (MCS) – paljude erinevate restriktaaside lõikekohad uuritavat järjestust (valkude korral tavaliselt cDNA kujul) reportergeeni (GFP, lacZ jt.) või märgise (FLAG, myc, V5, GFP) järjestust eukarüootset promootorit ja polüadenüleerimisjärjestust
51.Mobiilsed geenid e. transposoonid- genoomi ühest osast teise liikuvad lõigud. 52.Transformatsioon- geneetilise informatsiooni ülekandumine ühest bakterirakust teise rakust isoleeritud DNA abil. Võib toimuda ka looduslikes tingimustes. Sel juhul kandub elusrakkudesse surnud rakkudest vabanenud DNA. Transduktsioon- faagide poolt vahendatud geneetilise informatsiooni ülekanne ühest bakterirakust teise. 53. Geenide otsese ülekande meetodid: *süstlaga rakku süstimine-mikroinjektsioon *biolistika-raku "tulistamine" raskmetallidega *elektroporatsioon 54.Geenide ülekanne vektorite abil: Vektorid on vahendajad. Nende abil saab organisme geneetiliselt muundada.(Uus geen või selle product võib muuta org.ainevahetust, mille tulemusena võib tekkida kahjulikke aineid). nt bakterite plasmiidid- need võtavad võõrast DNAd keskkonnast kergesti sisse. Sellised plastiidid on agrobacteriumites. 55. Agrobacterium`i liigid kui vektorid geenide ülekandel taimedel:
Figure 2 illusteeriv pilt 4. Praktikum - transfektsioon Transfektsioon on võõr-DNA (plasmiidid) või RNA (siRNAd) viimine loomarakku. Transfekteerimiseks kasutatakse erinevaid võimalusi: keemilised meetodid (nt. kaltsiumfosfaat, katioonsed polümeerid, dendrimeerid, liposoomid ja katioonsed lipiidid) ja füüsikalised meetodid (nt. elektroporatsioon, sono-poratsioon, optiline transfektsioon, magnetogektsioon, mikroinjektsioon). Meie majas on kasutusel ka Amaxa Nucleofector –aparaat, mis kombineerib elektroporatsiooni ja keemilisi transfekteerimise meetodeid. Võimaldab efektiivsemalt transfekteerida rakke, mis muude meetoditega hästi ei taha transfekteeruda. Loomarakkudele mõeldud plasmiid sisaldab: • komponente, mis võimaldavad plasmiidi bakteris paljundada (origini- prokarüootset replikatsiooni alguspunkt, antibiootikumi resistentsusgeeni)
annaabi.ee 
