Enamus molekule rakus ei fluorestseeru ja seetõttu kasutatakse fluorestseeruvaid märgiseid. • Fluorestseeruvad värvid – diffundeeruvad rakku ja seostuvad märklauaga. N. DNA värvid propiidiumjodiid, Hoechst, DAPI jt • Immuunofluorestsents – kasutatakse fluorestseeruva märgisega (FITC, Alexa, Cy jt) konjugeeritud antikehasid. Enamasti tehakse kahekihiline reaktsioon, esmalt kasutatakse uuritava valgu vastaseid primaarseid antikehasid ja seejärel fluorokroomiga konjugeeritud sekundaarseid antikehi, mis seostuvad primaarse antikeha konstantsete regioonidega. See võimaldab signaali amplifitseerimist, sest ühe primaarse antikehaga saab seostuda mitu sekundaarset antikeha. Samuti kaob siis ära vajadus iga primaarse antikeha fluorokroomiga konjugeerimiseks. Esimene päev – rakkude fikseerimine Enne antikehadega värvimist tuleb rakud fikseerida, ehk töödelda neid kemikaalidega, mis peatavad neis bioloogilist protsessi, seega ka lagunemist
Võib olla põhjus selles, et ampitsiliin polnud nii effektiivne ja selektiivne. Need bakterid võiksid sattuda meie tassidele õhust, kuna selles praksiruumis tehakse töid paljude teiste preparaatidega. 63. 64.Sekveneerimise tulemuste analüüs 65. Tavaliselt kontrollitakse saadud plasmiidi kasutades Sangeri meetodit. See meetod põhineb PCR reaktsioonil kuhu on lisaks tavaliste nukleotiidalustele lisatud ka selliseid aluseid, mis om märgitud fluorokroomiga ja mille nukleotiidi ahelasse lülitamise järel DNA pol antud ahela pikendamise lõpetab. Kuna iga terminaalne ddNTP on märgitud erineva fluorokroomiga saab DNA järjestuse teada lahutades saadud reaktsiooni kapillaarelektroforeesil ja lugedes saadud kromatogrammilt flourestsents märgiste järgi meid huvitava DNA järjestuse. 66. Mina valisin analüüsiks 7-hRin-T7-G01, kuna minu järjestust ei olnud nimekirjas. 67
4. Nimeta erinevaid võimalusi rakukomponentide märgistamiseks fluorokroomidega? Fluorestseeruvad värvid: Difundeeruvad rakku ja seostuvad märklauaga. Näiteks DNA värvid propiidiumjodiid, Hoest, DAPI jt. Immuunofluorestsents: Kasutatakse fluorestseeruva märgisega (FITC, Alexa, Cy, jne.) konjugeeritud antikehasid. Enamasti tehakse kahekihiline reaktsioon, esmalt kasutatakse uuritava valgu vastaseid primaarseid antikehasid ja seejärel fluorokroomiga konjugeeritud sekundaarseid antikehi, mis seostuvad primaarse antikeha konstantsete regioonidega. Fluorestseeruvad valgud: Selleks ekspresseeritakse rakkudes uuritava valgu ja fluorestseeruva valgu liitvalku. Samas kannatab ka PFA-ga fikseerimist ja saab vaadata ka fikseeritud rakkudes. 5. Mis on Stokes'i nihe? Vahetult peale aine ergastamist toimub enamasti kiire termiline relaksatsioon mõnesugusesse energeetiliselt madalamasse seisundisse, millelt seejärel lähtub luminestsentskiirgus
võimaldab antikehadel rakku siseneda ning pääseda antigeenideni. Blokeerimise eesmärk on takistada antikehade ebaspetsiifilist seondumist nendesse kohtadesse, kuhu igasugused valgud kleepuvad. Primaarse antikehaga inkubeerimisel seondub primaarne antikeha antigeeniga antud juhul tubuliiniga. Inkubeerides sekundaarse antikehaga seonduvad sekundaarsed antikehad primaarse antikehaga. Kahekihiline reaktsioon on vajalik selleks, et poleks vaja iga primaarset antikeha fluorokroomiga konjugeerida, lisaks võimendab see signaali, kuna iga primaarse antikehaga saab seostuda mitu sekundaarset antikeha. Alusklaasidele panemine on vajalik mikroskopeerimiseks. Sulundamislahus sisaldab DAPI-t, mis seondub DNA-ga ning fluorestseerub siniselt, see võimaldab fluorestsentsmikroskoobiga näha ka DNA-d. 14. a. Kontroll-plasmiidiga rakud: Pildil on näha siniselt DNA, roheliselt edukalt transfekteeritud rakkudes ekspresseeritud GFP ning punaselt antikehaga värvitud tubuliin.
diferentsiaalvärvimise tulmusena saadud vöödistusi nimetatakse kõrglahutusvöödistuseks, HRB ehk kõrglahutus-tsütogeneetikaks, HRC. Maksimaalne lahutus on 1000-1250 vööti genoomi kohta. Üks vööt sisaldab tavaliselt 2-5 Mb DNA-d. Eukromatiini diferentsiaalvärvimine Eukromatiini värvimiseks on Q-, G- ja R-vöötide meetodid. Q-vöötide meetod töötati välja 1968. aastal. Selle meetodi puhul värvitakse kromosoome lühiajaliselt fluorokroomiga ja analüüsitakse seejärel fluorestsentsmikroskoobis. Töötluse tulemusena vahelduvad alad tuhmi hiilgusega aladega. G-vöötide meetod ehk GTG-meetod töötati välja 1971.aastal Seabright´i poolt. Meetod hõlmab endas kromosoomide lühiajalist mõjutamist trüpsiiniga ja värvimist Giemsa värviga. Piki kromosoomi saadakse tumedate ja heledate vöötide muster, mis langeb kokku Q-vöötide hiilgavate ja tuhmide alade vaheldumisega
leprae suhtes on vastuvõtlikum Lõuna-Ameerikas elunev sarvkilbilise rüüga loom üheksavöölane (Dasypus novemcintus). Leeprahaigelt võetud materjaliga nakatatud üheksavöölased haigestuvad 18–35 kuu möödumisel generaliseerunud leeprasse, mis sarnaneb leepra lepromatoosse vormiga inimesel. Pikk katseaeg on seletatav M. leprae äärmiselt aeglase paljunemisega kudedes - pooldumisaeg on 20– 30 päeva. Praktiline töö Ülesanne 1. Vaadelda tuberkuloosihaige rögast valmistatud ja fluorokroomiga värvitud äigepreparaati; joonistada ja kirjeldada. Mycobacterium tuberculosis Ülesanne 2. Tutvuda mükobakterite kasvatamiseks kõige sagedamini kasutatavate valiksöötmetega. Ülesanne 3. Vaadelda mükobakterite puhaskultuuri morfoloogiat Ziehl-Neelseni järgi värvitud preparaatides. Pöörata tähelepanu mikroobide paiknemisele ja happekindlusele (värvus).
annaabi.ee 
