(org>>org; org>>anorg ==boitroofid[parassidid, sümbioidid, loomad], sapotroofid [lagundajad, seened]) Energia kulub: sünteesiks, liikumiseks, ainete liikumiseks, keha soojendamiseks En.Saadakse: biooksüdatsiooni abil toitainest. En.varud:taimedestärklis, õlid; loomadesglükogeen, varurasv Makroenergilised ühendid: (NalussüsivesikP~P~P) ATP (adeniin, riboos), GTP (guaniin, r), CTP (tsütosiin,r), UTP (uratsiil,r), dATP (adeniin, desoksüriboos), dGTP (guaniin,d), dCTP (tsütosiin,d), dTTP (tümiin,d). En.salvestamine: ADP+H3PO4+en=ATP+H2O; ATP+H2O= H3PO4+ADP+en; ATP+S=SPi+ADP Fostosüntees: on protsess, kus valgusenergia muudetakse keemilise sideme energiaks (lähteained: H2O,CO2; saadused: glükoos, O2 ) Valgusstaadium: (valgus vajalik, lamellides) 1) fotofüüsikaline faas valguskvandi neelamine klorofülli poolt (e haaratakse elektronkandjate poolt seotakse NADPga) 2) fotokeemiline staadium vee
Ei nõua ainult vigastamata RNA, 20-100 korda tundlikum, kui eelmine meetod. Quantitative RT-PCR: Väga tundlik meetod, RNA peab olema puhastamata. Transkriptsiooni koha määramiseks võib kasutada: Nuclease S1 või primer extension. Ekson-intron piire kaardistatakse Nuclease C1 abil. 23. Millised on sarnasused ja erinevused Sanger ja Maxam-Gilbert meetodite vahel? Kirjelda DNA sekveneerimist Sangeri meetodi abil. Miks vahel kasutatakse dGTP analooge: dITP ja t-deaza-dGTP? Mõlema meetodi puhul kasutatakse isotoobi visualiseerimiseks ja elektroforeesi, kus toimub lahutamine. Ning samuti mõlemate meetodi puhul tekivad erineva suurusega DNA juppid (kas lõhustamise või sünteesi tulemusena). Dideoxy Chain Termination method ehk Sangeri sekveneerimismeetod (Joonis 5). Selles meetodis kasutatakse tavaliselt 4 reaktsiooni. Selleks võetakse üht DNA ahelat, lisatakse praimeri ja radioaktiivselt märgistatud isotoopi, selleks et hiljem visualiseerida produkti
4. DNA polümeraasid 5. Replikatsiooni algus ja initsiatsioon 6. Prokarüootne/eukarüootne mudel (tsirkulaarne/lineaarne kromosoom) 7. Telomeeride replikatsioon Replikatsiooni alternatiivsed mudelid Ultratsentrifuugimine gradiendis 1958: Matthew Meselson ja Frank Stahli katse, milles näidati, et repliktsioon on poolkonservatiivne 1955: Arthur Kornberg Töötas E. coli'ga. Avastas DNA sünteesi mehhanismi in vitro Vajalik neli komponenti: 1. dNTPs: dATP, dTTP, dGTP, dCTP (deoxyribonukleosiid 5'trifosfosfaadid) (suhkuralus + 3 fosfaati) 2. DNA matriits 3. DNA polümeraas I (Kornbergi ensüüm) (DNA polymeraas II ja III avastati veidi hiljem) 4. Mg 2+ (optimeerib polümeraasi aktiivsuse) 1959: Arthur Kornberg (Stanford University) ja Severo Ochoa (NYU) DNA süntees: 1. DNA polümeraas I katalüüsib fosfodiester sideme moodustumist deoksüriboosi 3'OH (viimasel nukleotiidil) ja dNTP 5'fosfaadi vahel
ülekanne 12. ATP jt makroergilised ühendid Ülesanne: energia salvestajad elusorganismides Koostis: Lämmastikalus-süsivesik-P~P~P~ ATP: adeniin-riboos-P~P~P~ GTP: guaniin-riboos-P~P~P~ CTP: tsütosiin-riboos-P~P~P~ UTP: uratsiil-riboos-P~P~P~ dATP: adeniin-desoksüriboos-P~P~P~ dGTP: guaniin-desoksüriboos-P~P~P~ dCTP: tsütosiin-desoksüriboos-P~P~P~ dTTP: tümiin-desoksüriboos-P~P~P~ ADP+PATP 30KJ Erinevus ATP ja nukleotiidi vahel: ATP-l on kolm fosfaatrühma, nukleotiidis üks fosfaatrühm 13. Ensüüm Mõiste: biokeemilise reaktsiooni kiirust reguleeriv valk Liigid: lihtensüüm (aminohappejäägid) ja liitensüüm (aminohappejäägid + muu aine (vitamiin))
minutis. DNA replikatsioon on ka erakordselt täpne protsess: nii prokarüootide kui eukarüootide replikatsioonil tekkiv viga on umbes 1 nukleotiid 109 nukleotiidi kohta – see teeb 3 nukleotiidi inimese genoomi kohta ühes rakujagunemises. DNA replikatsiooni biokeemia Iga vanemahela (matriitsahela) kohta sünteesitakse uus komplementaarne ahel. Sünteesi käigus lisatakse desoksüribonukleosiid trifosfaate, lühendatult dATP, dGTP, dCTP ja dTTP. Lisamise käigus lõigatakse ära 2 fosforhappe jääki ja DNA ahelasse liitub desoksüribonukleosiid monofosfaat, lühendatult dAMP, dGMP, dCTP ja dTMP. Süntees on 5’-˃3’ suunaline. Replikatsiooni käigus lisatakse üks nukleotiid korraga. Uue nukleotiidi suhkrujäägi 5’ otsa liidetakse eelmise nukleotiidi 3’ otsaga fosfaatjäägi kaudu. DNA replikatsioon on poolkonservatiivne
talletaja ja ülekandjana. · ATP on nukleotiid, mis koosneb lämmastikalusest(adeniin), süsivesikust(riboos), 3 fosfaatrühmast. · Koos fostaatrühma ülekandega salvastatakse 30 kJ energiat. · ATP moodustub glükolüüsil, fotosünteesil, hingamise käigus. GTP spetsiifiline makroergiline molekul (ka CTP, UTP). Nemad viivad läbi transkriptsiooniprotsessi, st RNA molekulide sünteesi. dATP, dGTP, dCTP ja dTTP on vajalikud DNA replikatsiooniks. Glükoosi lagundamine: (näide dissimilatsiooniprotsessist) See toimub kolmes etapis: 1. Glükolüüs 2. Tsitraaditsükli reaktsiooind (hingamine) 3. Hingamisahela reaktsioonid (hingamine) Toimub tsütoplasmavõrgustikus ensüümide toimel umbes 10 biokeemilise reaktsioonina. Keemiliste sidemete lõhkumisel tekib 2 x ATP. Glükoosi lagundamise üldvalem: C6H12O6 + 6O2 = 6CO2+ 6H2O + 38ATP
Kokkuleppeliselt kirjutakse RNA ja DNA primaarstruktuuri suunas 5´ 3´. 5´ ATTAGGAACCGG 3´ Fosfodiestersideme moodustumine ja stabiilsus Põhimõtteliselt võiks moodustuda dehüdratatsioonireaktsioonis: kuid G0=+25 kJ/mol Looduses kasutatakse aktiveeritud nukleotiide nukleosiid trifosfaate (NTP, dNTP). RNA (ATP, GTP, CTP ja UTP) DNA (dATP, dGTP, dCTP ja dTTP) G0= +25 + (31) = 6 kJ/mol Rakkudes toimub lisaks pürofosfaadi hüdrolüüs: PPi + H2O = 2Pi (G0= 31 kJ/mol). Summaarne G0=6 + (31) = 37 kJ/mol DNA molekuli suurus varieerub erinevates organismides Lihtsamates organismides on kogu genoomne DNA üks lineaarne või tsirkulaarne molekul Eukarüootsetel organismidel on mitu kromosoomi DNA moodustab kogu raku massist ligikaudu 1% Organism DNA (bp kokku) konformatsioon Viirused
jahutamisel toimuv ahelate reassotsiatsioon DNA REPLIKATSIOON Replikatsiooni lähtepunkt (origin) DNA piirkond, kus toimub pöördumine biheeliks mõttelise telje ümber ja ahelate lahtikeerdumine (despiraliseerumine). Eukarüootse DNA replikatsioon algab üheaegselt mitmest lähtepunktist. Replikatsiooni hark replitseeruva DNA Y- kujuline piirkond, kuhu seostuvad komplementaarsed nukleotiidid ja kus formeeruvad uued ahelad. Lähteained Nukleosiidtrifosfaadid dATP,dGTP, dTTP, dCTP, DNA sablonahel (template standart), RNA-praimer oligonukleotiid (4...60 nukleotiidi). Ensüümid ja katalüüsitavad protsessid. Helikaas DNA biheeliksi despiralisatsioon, DNA-polümeraasid polünukleotiidahelate süntees 5' 3' suunas (seotakse ühe nukleotiidi 3'-OH ja teise 5'- P). DNA-primaas oligonukleotiidse RNA-praimeri süntees. DNA-ligaas mahajääva ahela fragmentide ühendamine. Kuna uute polünukleotiidahelate süntees toimub 5' 3' suunas, siis üks
nukleotiidist edasi ei ole võimalik. Seda didesoksüribonukleotiidi saab ahelasse lülitada seepärast, et 5' positsioonis oleva süsiniku juures olevad fosfaatrühmad, mis moodustavad keemilist sidet, seega saab seda nukleotiidi panna eelmise normaalse nukleotiidi otsa, kui järgmist lülitada pole võimalik, kuna puudub vaba 3' hüdroksüülrühm. Oletame, et sünteesime in vitro uut DNA ahelat. Katseklaasis peavad olema DNA polümeraas (ensüüm), matriits DNA, nukleotiide ((dATP, dCTP, dGTP, dDTP)= dNTP). Kujutame, et neljas katseklaasis segame kokku sama lahuse. Oletame, et paneme esimesse natukene näiteks didesoksüATP'd. Sünteesuvad lühemad ahelad, millede lõppu me teame antud juhul A. //Elektroforees. Geel on klaaside vahel, geeli peale võime proove kanda, näiteks DNA'd. Pannes geeli elektrivälja, siis teatud (omades laengut) juhul võivad molekulid läbi geelis olevate pooride teise elektroodi poole
peab olema toksiline viirusele ja vähetoksiline peremeesorganismile. Antiviiruslik ravim § Blokeerima viiruse tungimise rakku või "töötama" raku sees § Enamus ravimeid on pürimidiini või puriini nukleosiidide analoogid. Acyclovir - toimemehhanism § Atsükliline guanosiini derivaat § Fosforüülitakse raku sees viirusliku tümidiin-kinaasi poolt § Di-ja tri-fosforüülimine premeesraku ensüümide poolt § Pärsib viirusliku DNA sünteesi: § konkureerib dGTP-ga viirusliku DNA polümeraasi pärast § viiruse DNA ahelasse sattudes lõppeb nukleiinhappe süntees. Antiretroviiruslikud ravimid (HIV ravimid) § Nukleosiidsed pöördtranskriptaasi inhibiitorid (Nucleoside Reverse Transcriptase Inhibitors -NRTI) § Mittenukleosiidsed pöördtanskriptaasi inhibiitorid (Nonnucleoside Reverse Transcriptase Inhibitors - NNRTI) § Proteaasi inhibiitorid § Fusiooni inhibiitorid § Integraasi inhibiitorid.
g., TTA|TTA|TTA). Telomeerne garanteerib programmeeritud rakusurma. Kui teda enam ei ole, siis rakk hukkub. DNA replikatsioon DNA süntees toimub poolkonservatiivselt. Tõestati ära Watson.Cricki mudel. Kovalentse sideme tagamiseks nukleotiidide vahel on vajalik DNA polümeraas ning Mg ioon, mis aktiveerib polümeraasi. DNAd on võimalik paljundada ja ta säilitab oma stabiilsuse. 1955: Arthur Kornberg avastas DNA sünteesi mehhanismi in vitro. Vajalik neli komponenti: dNTPs: dATP, dTTP, dGTP, dCTP (deoxyribonukleosiid 5'-trifosfosfaadid) (suhkur-alus + 3 fosfaati) DNA matriits DNA polümeraas I (Kornbergi ensüüm)(DNA polymeraas II ja III avastati veidi hiljem) Mg 2+ (optimeerib polümeraasi aktiivsuse) DNA süntees: DNA polümeraas I katalüüsib fosfodiester sideme moodustumist deoksüriboosi 3'-OH (viimasel nukleotiidil) ja dNTP 5'-fosfaadi vahel. Energia saadakse kahe fosfaatrühma vabanemisel. DNA polümeraas I "leiab ülesse" õige komplementaarse dNTP kogu
DNA replikatsioon on ka erakordselt täpne protsess: nii prokarüootide kui eukarüootide replikatsioonil tekkiv viga on umbes 1 nukeotiid 109 nukleotiidi kohta – see teeb 3 nukleotiidi inimese genoomi kohta ühes rakujagunemises. DNA replikatsioon on poolkonservatiivne – see tähendab, et replikatsiooni käigus sünteesitakse (kopeeritakse) mõlema vanemahela pealt uus komplementaarne tütarahel. Sünteesi käigus lisatakse desoksüribonukleosiid trifosfaate, lühendatult dATP, dGTP, dCTP ja dTTP. Lisamise käigus lõigatakse ära 2 fosforhappejääki ja DNA ahelasse liitub desoksüribonukleosiid monofosfaat, lühendatult dAMP, dGMP, dCMP, dTMP. Süntees on alati 5’-3’ suunas. Uue nukleotiidi suhkrujäägi 5’ ots liidetakse eelmise nukleotiidi 3’ otsaga fosfaatjäägi kaudu. Samaaegselt toimub DNA lahtikeerdumine ja replikatsioon. Ori-regioonid on alati A-T rikkad, praimeriks DNA või RNA või valguga seondunud nukleotiidid, praimerit on vaja selleks, et
defektsusel. 78 Replikatsioonil viib DNA polümeraas GO võrdse efektiivsusega nii C kui A vastu (3% efektiivsusest, millega ta õiget nukleotiidi inkorporeerib). GO valepaardumisest põhjustatud asendusmutatsioonide vältimiseks on E. coli's olemas 3 valku MutM, MutT ja MutY. MutT on ennetava funktsiooniga ta lagundab rakkudes GO-d. MutT omab dGTPaasset aktiivsust, mis on 8-oxodGTP suhtes võrreldes dGTP-ga 3 suurusjärku kõrgem. MutM ja MutY on glükosülaasid. MutM ja MutY-defektsetes rakkudes tõuseb GC TA transversioonide osakaal. MutM kõrvaldab DNA ahelast GO. MutY kõrvaldab valesti paardunud A nii A/G kui A/GO puhul. Kahjustuste kõrvaldamine võib toimuda ka valesti. Näiteks, kui A vastu lülitub GO, võib MutY DNA ahelast kõrvaldada hoopis A ning kui järgmise replikatsioonitsükli käigus lülitub GO vastu C, toimub selle tulemusena asendus AT CG.
annaabi.ee 
