F 1,728 1,669 1:10 G 0,048 0,044 H 0,232 0,071 Katse tulemus näitab ,et plaati süvendites on olemas kartuli X viirus. Kahekordne radiaalne immunodifusioon. Meetodit kasutatakse antigeenide ja antikehade identifitseerimiseks ja kvalitatiivseks analüüsiks rakuekstraktides, seerumites. Meetod on spetsiifiline ja tundlik, kui antigeen/ antikeha suhe on optimaalne. Töö käik: · Peetri tassis , kus on tardunud agaroosgeel teeme 7 süvendit vastava sablooniga ,,lilleke". · Teeme antigeeni BSA vastavad proovilahjendused (1:2; 1:4; 1:8; 1:16; 1:32; 1:64).Igasse auku kanname 10µl proovi. · Keskele kanname 10µl antikeha (anti-BSA polüklonaalsed antikehad). · Tass asetame külmutuskappi 4 kraadi juurde. Töö tulemus: Minu tassis oli optimaalne antigeen/antikeha suhe 1:64 lahuse juures.
RNaas lagundab RNA rakkudes. 11. Millist tüüpi restriktaase kasutame? tüüp 2 - lõike- ja seondumissait kattuvad. Lõikavad vaid dsDNA-d (ainult ds lineariseerub, ss jääb tsirkulaarseks - tsirkulaarne jookseb geelil kiiremini - saab neid eristada). Tunneb ära 6-nukleotiidilise järjestuse GAATTC. Vajab tööks Mg ++. Lõigatud otsad jäävad üheahelaliseks (aka. kleepuvad otsad). 12. Miks ei või geeli vette teha vaid peab puhvrisse panema? Agaroosgeel peab olema tehtud puhvrisse, sest kui seda jooksutada ka puhvris ja kui geel on tehtud vette, siis Tris puhver tõmbab geelist vee välja. Tagab stabiilse pH. Oluline, sest DNA/RNA laeng sõltub keskkonna pH-st. 13, Miks kasutatakse laadimispuhvrit ja mis on see tavaliselt? DNA proovide kandmisks geelile kasutatakse laadimispuhvrit, mis sisaldab glütserooli. Proov vajub kaevukese põhja. 13. Miks sisaldab puhver ka etiidiumbromiidi?
lõppkontsentratsioon: 0,05µg/ml Saame teada, mitu µg meil on EtBr vaja: 80 x 0,05 = 4µg Mitu µl on EtBr vaja? 10/4 = 1/x ehk x = 4/10 = 0,4µl Praktiline töö nr. 3: DNA lahutamine agaroosgeelis Eesmärk: PCR produkti lahutamine geelelektroforeetiliselt. Materjalid: 18 µl PCR produkt DNA, mida visualiseerima 3,6 µl DNA laadimispuhver DNA visualiseerimiseks ja paremini hambasse vajutamiseks. TAE agaroosgeel GeneRuler 100bp Plus Marker DNA fragmentide pikkuse ning Ladder koguae ligikaudseks kvantifitseerimiseks Arvutused: Meil on 20 µl PCR produkti, kust võeti 2 µl ära. DNA laadimispuhvri koguse jaoks teeme arvutuse: 18/5 =3,6 µl Töö käik: Pipeteerin PCR segule 6x DNA laadimispuhvri. Pipeteerime markeri geeli esimesse hambasse. Pipeteerin enda segu geeli hambasse.
Sulge tuub ja sega intensiivselt (tekib plasmiidse DNA sade, RNA jääb osaliselt supernatanti). (7) Tsentrifuugi maksimaalsel kiirusel 8-10 min. Eemalda supernatant täielikult ja lahusta sade 100 l TE + Ribonukleaasi A (5 g/ml) lahuses (RNA lagundamiseks). Inkubeeri saadud lahust 37 oC juures ~30 min. Vt lisaülesanne 3.2. 1) suurem osa 1000 l pipetigakiirtsentrifuug 2) väiksema pipetiga eemaldasin ülejäänu supernatandi (8) Samal ajal valmista 1 x TBE 0,8% agaroosgeel DNA analüüsiks (grupi peale). Selleks on vaja 80 ml TBE puhvrit ja ... g agaroosi. Keeta mikrolaineahjus kuni agaroos on lahustunud. Jahutada vesivannis ja lisada DNA nähtavaks tegemiseks 1 l EtBr (5 g/l). Valada geel vormi, kuhu on varem valmis pandud nn ,,kamm" või ,,hambad". ~30 min pärast on geel tardunud. 8 (9) Peale 30 min inkubatsiooni teosta DNA-le fenooltöötlus
sadestamiseks). (6) Eemalda supernatant (~900 l) ja kanna valmispandud tuubi. Sulge tuub ja sega intensiivselt (tekib plasmiidse DNA sade, RNA jääb osaliselt supernatanti). (7) Tsentrifuugi maksimaalsel kiirusel 8-10 min. Eemalda supernatant täielikult ja lahusta sade 100 l TE + Ribonukleaasi A (5 g/ml) lahuses (RNA lagundamiseks).Segame Vortexiga ja vuugime 1-2 minutit. Inkubeeri saadud lahust 37 oC juures ~30 min. Vt lisaülesanne 3.2. (8) Samal ajal valmista 1 x TBE 0,8% agaroosgeel DNA analüüsiks (grupi peale). Selleks on vaja 80 ml TBE puhvrit ja ... g agaroosi. Keeta mikrolaineahjus kuni agaroos on lahustunud. Jahutada vesivannis ja lisada DNA nähtavaks tegemiseks 1 l EtBr (5 g/l). Valada geel vormi, kuhu on varem valmis pandud nn ,,kamm" või ,,hambad". ~30 min pärast on geel tardunud. Punkt 9 jääb vahele. (9) Peale 30 min inkubatsiooni teosta DNA-le fenooltöötlus. See on vajalik RNaasi eemaldamiseks. Selleks:
Selleks hoitakse geeli 30-45 min toatemperatuuril foreesipuhvris või destilleeritud vees, kuhu on lisatud EtBr (0,5 µg/ml). Tausta helenduse vähendamiseks võib EtBr-ga värvitud geeli loputada 20 min toatemperatuuril destilleeritud vees. • Polüakrüülamiidgeelide hõbetamist. See on tehniliselt keerulisem kui EtBr-ga värvimine, kuid samas tundlikum. Geelelektroforeesi protokoll MATERJALID JA APARATUUR PUHVRID JA LAHUSED. • Agaroosgeel saadakse agaroosi kuumutamisel koos puhvriga, kuni lahus on selge ja läbipaistev. Seejärel valatakse agaroosilahus geelialusele ja lastakse tarduda. • Elektroforeesipuhver (tavaliselt 1× TAE või 0,5× TBE). • Etiidiumbromiid, • Geeli pealekandmispuhver (gel loading dye) MOLEKULMASSI MARKER. • DNA suurusmarker (size standard). Teadaoleva suurusega DNA proovid saadakse tavaliselt plasmiidi või bakteriofaagi DNA lõikamisel restriktsiooniensüümidega. Hea oleks omada nii
annaabi.ee 
