destilleeritud vees, sobivas puhvris või nõrgas NaCl lahuses. Kolonni voolutamine Minu kasutatud voolutuslahuse koostis on 10mmolaarne tris ja 0.15 mol sool, pH=7.4. Seni kuni kolonni alaossa jõuab kõige kiiremini liikuv komponent, väljub kolonnist puhas vooluti, mis täidab geeliterade poore ja teradevahelist ruumi. See osa eluaadist kogutakse ühendatud fraktsioonina. Enne voolutamise algust asetatakse kolonni väljalaskeava alla 100 ml kuiv kolb. Ühendatud fraktsiooni maht tuleb mõõta, sest see moodustab osa kogu elueerimismahust ja tuleb kromatogrammi koostamisel arvesse võtta. Kui proov oli geeli pinnale kantud, avasin kolonni väljavooluu ja hakkasin eluaati koguma. Kui proov sisenes täidisesse, viisin kiiresti pipeti abil geeli pinnale väikese koguse voolutuslahust ja lasin täidisesse imbuda
Vv). Dekstraansinine on kõrgmolekulaarne dekstraan (Mr = 2*106), mille külge on kovalentselt seotud sinine värvaine, mistõttu ta omab neeldumismaksimumi max lainepikkusel 625 nm. Lisaks sisaldas uuritav segu Müoglobiini (6mg/ml), mille molekulmass on 16800 Da ja DNP- aspartaati (0,3 mg/ml). Kolonni voolutamine Enne kõige kiiremini liikuvat komponenti (dekstraansinist) kolonnis väljuva puhta vooluti kogun ühendatud fraktsioonina, milleks asetan enne voolutamise algust kolonni väljalaskeava alla 100 ml kuiva kolvi. Olnud proovi eelkirjeldatud viisil geeli pinnale kandnud, avasin väljavoolu kolonnist ja hakkasin eluaati koguma ülalnimetatud kolbi. Niipea kui proov oli täidisesse sisenenud, viisin kiiresti pipeti abil geeli pinnale väikse koguse (0,5-1 ml) voolutuslahust ja lasin täidisesse imbuda. Sama kordasin veel teisegi korra ja alles seejärel, kui olin veendunud, et kogu uuritav
kolonnist puhas vooluti. · Kui proov on geeli sisenenud viiakse pipeti abil kiiresti väike kogus voolutit ja lastakse imbuda. Korratakse veel kord sama. · Kui proov on täielikult geeli imbunud kantakse geeli pinnale suurem hulk voolutit. · Kui esimene värviline riba on kolonnis lähenemas põhjale, eemaldatakse kolb ning hakatakse eluaadti koguma 2 ml mahu kaupa katseklaasidesse. · Kogu voolutamise vältel jälgitakse, et geeli kohal oleks piisavalt eluenti ja seda lisatakse vajadusel pidevalt juurde. · Elueerimise võib lõpetada, kui eluaat muutub värvituks ja eluaadi summaarne maht ei ole väiksem kui kolonni kogumaht. Kogutavate fraktsioonide üldarv peab vastama varem väljaarvutatule. Fraktsioonide analüüsimine · Aine kontsentratsiooni väljendatakse optilise tiheduse väärtusena, mis mõõdetakse vastaval lainepikkusel spektrofotomeetris.
mõõtpipetti, mille otsas on tükike peenikest voolikut. · Pipeti võtsin juhendaja poolt määratud 1 ml uuritavat proovi ja viisin selle kolonni, jättes pipeti otsa umbes 5 mm kaugusele geeli pinnast. · Proovi lasin tilkuda geeli pinnale nii, et see seal võimalikult ühtlaselt jaotuks. Proovi sisestamise ajal hoidsin kolonni väljavooluava suletud. Kolonni voolutamine. · Enne voolutamise algust asetasin asetasin väljalaskeava alla 100 ml mõõtesilindri. · Pärast proovi geeli pinnale kandmist, avasin väljavoolu kolonnist ja eluaati hakkasin koguma mainitud mõõtesilindrisse. · Kohe, kui proov oli täidisesse sisenenud, viisin kiiresti pipetiga geeli pinnale väikese koguse (0,5 1 ml) voolutuslahust ja lasin sellel täidisesse imbuda. · Sama kordasin teisegi korra.
väljavooluavat. Ning mõne aega pärast, segu hakkab lahutama: allpool on dekstraansinine, keskel müoglobiin ja üleval on kollase värvusega DNP-aspartaam. See on sellepärast, et kõige suurem molekulmass on dekstraansinisel st. 2·106, ning müoglobiini molekulmass on 16800 ja DNP- aspartaadi mass on kõige väiksem. Kui dekstraansinine jõuab kolonni põhjale siis hakatakse eluaadi kogumist 2ml mahuga fraktsioonidena kaliibritud ja eelnevalt nummerdatud katseklaasidesse. Kogu voolutamise vältel tuleb · jälgida, et kolonni täidise kohal oleks piisavalt eluenti ja seda vastavalt vajadusele juurde lisada, · vahetada õigeaegselt katseklaase, et eluaat saaks kogutud täpselt 2 ml fraktsioonide kaupa. Elueerimise lõpetamise üle otsustasin eluaadi värvituks muutumise järgi (värviliste proovide korral). Sain koguda 26 katseklaasi 2ml-ga eluendiga. Ka mõtsin vooluti osa (nn ühendatud fraktsiooni) maht 23 cm3
väljavooluavat. Ning mõne aega pärast, segu hakkab lahutama: allpool on dekstraansinine, keskel müoglobiin ja üleval on kollase värvusega DNP-aspartaam. See on sellepärast, et kõige suurem molekulmass on dekstraansinisel st. 2·106, ning müoglobiini molekulmass on 16800 ja aspartaami mass on kõige väiksem st 294,301. Kui dekstraansinine jõuab kolonni põhjale siis hakatakse eluaadi kogumist 2ml mahuga fraktsioonidena kaliibritud ja eelnevalt nummerdatud katseklaasidesse. Kogu voolutamise vältel tuleb · jälgida, et kolonni täidise kohal oleks piisavalt eluenti ja seda vastavalt vajadusele juurde lisada, · vahetada õigeaegselt katseklaase, et eluaat saaks kogutud täpselt 2 ml fraktsioonide kaupa. Elueerimise lõpetamise üle otsustasin eluaadi värvituks muutumise järgi (värviliste proovide korral). Sain koguda 26 katseklaasi 2ml-ga eluendiga. Ka mõtsin vooluti maht st Vv = 23 cm3. NB
Türoglobuliin 670 000 Kolonni voolutamine Peame silmas, et seni, kuni kolonni alaossa jõuab kõige kiiremini liikuv komponent (dekstraansinine), väljub kolonnist puhas vooluti, mis täidab geeliterade poore ja teradevahelist ruumi. Selle kogumine 2 ml-te fraktsioonidena pole otstarbekas. Seetõttu võib selle osa eluaadist (ei sisalda uuritava segu komponente) koguda ühendatud fraktsioonina, milleks enne voolutamise algust asetatakse kolonni väljalaskeava alla 100 ml kuiv kolb. NB! Ärge unustage mtmast ühendatud fraktsiooni mahtu! See moodustab osa kogu elueerumismahust ja tuleb kromatogrammi koostamisel arvesse võtta. Mahu mõõtmiseks kasutatakse sobiva suurusega mõõtsilindrit. Olles proovi eelkirjeldatud viisil geeli pinnale kandnud, avatakse väljavool kolonnist ja eluaati hakatakse koguma ülalnimetatud kolbi. Niipea kui proov on täidisesse sisenenud, viiakse kiiresti (NB
annaabi.ee 
