V Inkubatsioon sekundaarse antikehaga. 1. Valmistada sekundaarse antikeha lahjendused 0,2% BSA-PBS lahuses (vaja on kahe klaasi jagu, seega kokku 2x200=400µl). a. 40 µl 2% BSA lahust b. 360 µl 1x PBSi c. Goat anti mouse Alexa546 1:2000 0,2 µl, segada. 2. Inkubeerida 45-60 minutit toatemperatuuril, kaitsta valguse eest. 3. Pesta 3 korda 5 minutit 1 ml PBS-Tweeniga. 4. Pesta 2 korda 5 minutit 1 ml PBSiga. 5. Pesta 1 kord 1 ml milliQ (destilleeritud) veega. VI Alusklaasidele panemine ehk sulundamine 1. Kirjuta alusklaasile oma nimi ja kuupäev, samuti kasutatud antikeha. 2. Pigistada tuubist alusklaasidele väike tilk DAPIga sulundamislahust. 3. Võta katteklaas pintsettide vahele ja kuivata serv vastu pehmet paberit. 4. Aseta katteklaas (rakud allpool !!!) sulundamislahuse tilga sisse (väldi mulle). 5. Lasta kuivada ja säilitada pimedas. b. Lahjenduste tegemise arvutused: 1) Primaarse antikeha lahjendus: Vaja on 400 µl lahust, kuna meil on 2 klaasi, kummagi kohta 200 µl
Pärast pesta 3 korda 5 minutit 1 ml PBS-Tweeniga seondumata antikeha eemaldamiseks 2. Inkubatsioon sekundaarse antikehaga. Valmistada 0,2% BSA-PBS lahus (400 μl): 40 μl 2% BSA lahust + 360 μl 1x PBS-Tweeni + Goat anti mouse Alexa568 (punast värvi) 0,2 μl, segada. Inkubeerida 45-60 minutit toatemperatuuril, kaitsta valguse eest. Pesta 3 korda 5 minutit 1 ml PBS-Tweeniga. Pesta 2 korda 5 minutit 1 ml PBSiga. Pesta 1 kord 1 ml MQga. 3. Alusklaasidele panemine ehk sulundamine. Kirjutada alusklaasile oma nimi, kuupäev ja kasutatud antikeha. Pigistada tuubist alusklaasidele väike tilk DAPIga sulundamislahust. Sulundamislahuses olev DAPI seondub rakus DNAga ja fluorestseerub siniselt. Võta katteklaas pintsettide vahele ja kuivatada serv vastu pehmet paberit. Asetada katteklaas (rakud allpool!) sulundamislahuse tilga sisse (vältida mulle) Lasta kuivada ja säilitada pimedas 157. 158
1. Histoloogiliste preparaatide valmistamise põhietapid 1. Materjali võtmine 2. Fikseerimine – säilitatakse koed võimalikult elupuhusena 3. Veetustamine 4. Sisestamine – materjal muutub kõvemaks 5. Lõikamine mikrotoomil 6. Värvimine –nt hematoksüliin-eosiin (HE), H värvib raku tuuma ja E raku tsütoplasma. 7. Sulundamine - värvitud preparaadile lisatakse palsamit ja kaetakse katteklaasiga. Sulundamine kaitseb rakulist materjali kuivamis-artefaktide ja kokkutõmbumise eest, muudab värvingu selgeks. 2. Raku mõiste, üldine ehitus Rakk (cellula) on väikseim üksus, millel on kõik elu tunnused. Rakku ümbritseb rakumembraan, mille põhilipiidid (fosfolipiidid) moodustavad fosfolipiidse kaksikihi. Lisaks lipiididele esineb veel valke, süsivesikuid, kolesterooli. Raku elussisu (va rakutuum) on tsütoplasma, kus asuvad kõik raku organellid. Kahekordse membraaniga organellid
Sobiv fluorokroom tuleb valida selle järgi, milliseid teisi fluorokroome veel samal preparaadil kasutate. Praktikas kasutatakse korraga tavaliselt 2-3 antikeha, on võimalik ka rohkem. Fluorokroomid on üldiselt tundlikud valguse suhtes, sellepärast on vajalik ka neid liigse valguse eest kaitsta. • Pesta 3 korda 5 minutit 1 ml PBS-Tweeniga. Pesta 2 korda 5 minutit 1 ml PBSiga • Pesta 1 kord 1 ml MQga Alusklaasidele panemine ehk sulundamine, selleks on vaja: • Pigistada tuubist alusklaasidele väike tilk DAPIga sulundamislahust. Sulundamislahuses olev DAPI seondub rakus DNAga ja fluorestseerub siniselt. Sulundamislahus “kleebib” rakku Dega katteklaasi alusklaasile ning aitab preparaadil pikemaajaliselt säilida ning ei lase fluorokroomidel aja jooksul tuhmuda. • Võta katteklaas pintsettide vahele ja kuivatada serv vastu pehmet paberit.
Veetustamine Sisestamine – sisestusliinid võimaldavad nii koe fikseerimist, veetustamist kui ka immutamist parafiiniga Lõikamine – parafiinblokkidest lõigatakse õhukesed lõigud, mis asetatakse alusklaasile ja kuivatatakse 12-24h Värvimine – et hinnata preparaati, tuleb värvida, kasutatakse erinevaid värvimismeetodeid (nt H&E värving) Sulundamine RAKU MÕISTE, ÜLDINE EHITUS, SUURUS JA KUJU Rakud on välismembraaniga ümbritsetud imetajate organismi väiksemad morfofunktsionaalsed ühikud Rakkudel on kaks põhikomponenti: tsütoplasma (tsütoplasmaatilises maatriksis e tsütosoolis paiknevad inklusioonid) ja rakutuum – tuumake on rakutuumas selgelt eristuv piirkond Igal rakutüübil on talle iseloomulik suurus ja kuju, mille tagab raku välismembraan e plasmamembraan, mis talitleb
annaabi.ee 
