a. Footprinting. Märklaud geenid ei sisalda TATAboxi. 18. Miks kasutatakse "heat-shock" geenide promootoreid? a. Sidumine proksimaalse elemendi teatud järjestusele stimuleerib peatunud RNA-polII jätkama elongatsiooni ja indutseerib kiiret reinitsiatsiooni uute RNA-polII molekulidega. 19. Mida tähendab väljend "kasutades lacZ reporterina" ja mis analüüsi- meetodiga on tegu? Transgeenne analüüs. a. Reportergeen viiakse uuritavasse rakku... 20. Defineeri enhancer ja loetle enhanceri omadused. Missuguseid analüüsi-meetodeid kasutatakse enhanceralade tuvastamiseks? a. Enhancer lühike DNA ala, mis seob aktivaatoreid (valgud), initsieerib transkriptsiooni läbi mediaatorkompleksi. b. Tuvastamiseks kasutatakse linkerskaneeritud, mutatsioon analüüs/geelelektro-foreesi ja autoradiograafiat, footprinting. 21
Heat-shock geenide transkriptsioonil peatub PolII pärast esimese 25 bp sünteesi, aga ei termineeri transkriptsiooni. Transkriptsioon jätkub pärast seda, kui keskkonnamuutuse mõjul on aktiveerunud HSTF (heat-shock transkriptsiooni faktorid). 19. Mida tähendab väljend "kasutades lacZ reporterina" ja mis analüüsimeetodiga on tegu? Transgeenne analüüs. Ei tea täpselt, aga pmst luuakse DNA konstrukt, milles on uuritav sidumissait (näiteks mingi UAS), TATA-box ja reportergeen (siin lacZ geen). Reportergeen valitakse selline, mille produktide aktiivsust on lihtne määrata ja järeldusi teha. Sellist meetodit nim ilmselt siis transgeenseks analüüsiks?? 20. Mis on transkriptsioonilise aktivaatori 2 funktsionaalset domääni ja kuidas mutatsioonid ühes või teises neist mõjutavad transkriptsiooni faktori omadusi? Nii transkriptsiooni aktivaatoritel kui ka repressoritel on 2 funktsionaalset domääni: DNA'd siduv domään ja
siis lõigataks meie kodeeritava ala keskelt fragment pooleks, aga me tahame tervet kodeeritavat ala saada. Ümberkloneerimist ei saa teha vaid ühte restriktaasi kasutades, kuna pärast me ei saaks kontrollida kumba pidi insert vektorisse siseneb. Meil on vaja aga, et ta õiget pidid siseneks, muidu me ei saa funktsionaalset valku. Doonorplasmiid pSTBlue1 vektor koos meie inserdiga Aktseptor plasmiid pEGDP-C Reportergeen EGFP Insert DST Ümberkloneerimiseks kasutatavad restriktaasid BamHI ja SalI Millistel tingimustel restriktsiooni reaktsioon läbi tuleks viia? Millise pikkusega fragmendid saame ja mida kasutame ligeerimisel? Double Digest soovitaks meie reaktsiooniseguks: 16 1x BamHI puhver 1x BamHI 2x SalI Incubate at 37°C
avaldumisele on uuritaval regulaatoril tugevam efekt ja siis, kui regulaatorvalk seondub ühte kindlasse saiti promootorala ees. Samas valgud, mis seonduvad paljudesse saitidesse, interakteeruvad tavaliselt ka teiste valkudega. Valkude kooperatiivsel seondumisel DNA-ga ei pruugi uuritava valgu seondumissait olla DNA järjestuse põhjal ennustatav. 2. Reportergeenide kasutamine transkriptsiooni liitjärjestuste konstrueerimiseks. Promootorita reportergeen (näiteks lacZ) inserteeritakse genoomi erinevatesse piirkondadesse, nii et see satub erinevate promootorite kontrolli alla. Edaspidi on võimalik uurida, milliste geenide promootorite kontrolli all muutub reportergeeni ekspressioonitase (tõuseb või langeb) vastusena stressifaktoritele. Kromosomaalsete liitjärjestuste tekkimine võib viia märklaudgeeni aktiivsuse pärssimisele. Reportergeeni poolt kodeeritud valk võib rakus ka ise stressi indutseerida. 3
Valkude kooperatiivsel seondumisel DNA-ga ei pruugi uuritava valgu seondumissait olla DNA järjestuse põhjal ennustatav. Suur osa operone on reguleeritavad mitmete erinevate faktorite kooperatiivse seondumise kaudu. Lisaks raskesti ennustatavusele on sellised saidid sageli ka eksperimentaalselt raskesti tõestatavad. 2. Reportergeenide kasutamine transkriptsiooni liitjärjestuste konstrueerimiseks. Promootorita reportergeen (näiteks lacZ) inserteeritakse genoomi erinevatesse piirkondadesse, nii et see satub erinevate promootorite kontrolli alla. Edaspidi on võimalik uurida, milliste geenide promootorite kontrolli all muutub reportergeeni ekspressioonitase (tõuseb või langeb) vastusena stressifaktoritele. Näiteks P-nälja korral indutseerub bakteris E. coli üle 50 geeni ekspressioonitase. Ka selle meetodi rakendamisel on probleeme
annaabi.ee 
