Praktiline töö I Rakkude külmutamine/sulatamine 1. Milleks on söötmesse lisatud antibiootikumid? Et bakterid vohama ei hakkaks 2. Milleks on söötmesse lisatud pH indikaator? Enamus rakuliine vajab kasvamiseks temperatuuri 37°C ja pH-d vahemikus 7,2-7,4. pH indikaatorina kasutatakse fenoolpunast. pH muutumisel happelisemaks muutub indikaator kollaseks ja pH muutumisel aluselisemaks muutub indikaator lillamaks. Rakud taluvad happelist keskkonda paremini kui aluselist. 3. Nimeta sagedasemaid rakukultuuri saastajaid. Pärm, bakterid, mükoplasma, viirused, teised rakuliinid 4. Mis on rakuliin ja rakkude primaarkultuur, mille poolest need erinevad?
Millised on monoklonaalsed antikehad? Monoklonaalne antikeha - antikeha, mis on produtseeritud ühe raku või rakuliini poolt, mis on ühest rakust arenenud. On identsed ja omavad unikaalset aminohappe järjestust, kasvavad identselt. Reageerivad vaid ühe epitoobiga antigeeni molekulis. Homogeenset antikehade populatsiooni on võimalik saada B lümfotsüütide liitmisel kasvajarakkudega. Saadud rakuliine kutsutakse hübridoomideks . Monoklonaalsed antikehad tekivad kui ühendada B-lümfotsüüdid kasvajarakkudega, need on hübridoomid. Selektiivsöötmel jäävad ellu ainult hübridoomid. Nüüd on puhas kultuur ühte tüüpi antikehi tootavatest, hästi paljunevatest rakkudest. Mis on roheline fluorestseeruv valk, milleks ja kuidas seda kasutatakse? See on meduusist saaadud geen, mis floresseerub rohelises vahemikus ja mis teise
Fuugida rakud põhja 5 min 1000 rpm toatemperatuuril (kuna rakud on õrnad, kiirus ei tohi olla üle 1000 rpmi). 5. Pärast fuugimist tuleb tõmmata vaakumpumbaga sööde rakkudelt, kasutades Pasteuri pipeti ning steriilset otsikut. 6. Tuubile rakkudega lisada 0,5 ml söödet (6 cm tassilt), suspendeerida ning panna tagasi tuubist tassile. Teha tassiga 8-kujulisi liigutusi, et rakud tassil ühtlaselt jaotuksid ning asetada oma tass CO2 inkubaatorisse. 90. Enamus rakuliine vajab kasvamiseks temparatuuri 37 °C ja pH-d vahemikus 7,2 – 7,4. Selliste tingimuste tagamiseks kasutatakse spetsiaalseid inkubaatorkappe, kus lisaks vajalikule temp. on ka kõrgem CO2 sisaldus (5%), mis võimaldab stabiilse pH säilitamise. 91. 92. Teine päev – rakkude paljundamine 93. Esmalt tuleb rakkud vaadelda mikroskoobis, et hinnata nende tihedust ning seisukorda. Rakud ei ole saastanud ega surnud ning nende tihedus on umbes 20%. 1
vastus. Korratakse mitu korda. Iga süstimse tulemusena tekib järjest kõrgema tiitriga antiseerum, mis sisaldab suures hulgas IgG antikehi. 4. Antiseerum saadakse looma verest. Lastakse hüübida, eemaldatakse erütrotsüüdid ja teised vererakud ning mõningad seerumvalgud. 5. Antikehade puhstamine antiseerumist. Homogeenset antikehade populatsiooni on võimalik saada B lümfotsüütide liitmisel kasvajarakkudega. Saadud rakuliine kutsutakse HÜBRIDOOMIDEKS. Toodavad ühte kindlat liiki antikehi MONOKLONAALSEID ANTIKEHI (MKA). Reageerivad vaid ühe epitoobiga antigeeni molekulis. On identsed antikehad, toodetakse ühe klooni poolt. B-RAKKUDE ARENG hõlmab kahte faasi: 1) AG-sõltumatu B-rakkude küpsemise faas luuüdis; 2) küpsete B-rakkude antigeenist sõltuv aktivatsioon ja differentseerumine perifeerias, mille tulemusena tekivad antikehi sekreteerivad plasmarakud ja mälu B-rakud.
patsientide veres kuni tuhat korda. 14. Polüklonaalsed antikehad. Monoklonaalsed antikehad (Hübridoomi tehnoloogia) Monoklonaalne antikeha on antikeha, mis on produtseeritud ühe raku või rakuliini poolt, mis on ühest rakust arenenud. On identsed ja omavad unikaalset aminohappe järjestust, kasvavad identselt. Reageerivad vaid ühe epitoobiga antigeeni molekulis. Homogeenset antikehade populatsiooni on võimalik saada B lümfotsüütide liitmisel kasvajarakkudega. Saadud rakuliine kutsutakse hübridoomideks . PKA tunnevad ära ja seostuvad paljude epitoopidega antigeeni molekulid. Saadakse loomade (kits, küülik jne) korduval süstimisel vastava antigeeni lahusega. Vereseerum kogutakse organismist antikehade produktsiooni tipul. Sel viisil on võimalik saada spetsiifilist IgG-d ligi 1-10mg/ml seerumi kohta. Polüklonaalsed antikehad on tolerantsemad antigeeni muutustele. 15. Antikehade repetuaari paljususe genereerimine (üldjoontes)
Oluline on vaid see, et hübriidses rakus konkreetne geen avalduks ning et ta oleks eristatav hiire vastavast geeniproduktist. Näiteks UMP kinaasi geen lokaliseeriti esimesse kromosoomi. Inimese ja hiire UMP kinaase on võimalik eristada geelelektroforeesiga. Valkude aminohappelises järjestuses on mõned erinevused ja see kajastub nende ensüümide erinevas liikuvuses geelelektroforeesil. Kui analüüsiti erinevaid 49 hübriidseid rakuliine, siis oli inimese UMP kinaas alati esindatud ainult nende hübriidide korral, mis sisaldasid esimest inimese kromosoomi. Tänapäeval kasutatakse inimese geenide tuvastamiseks hübriidsetest rakkudest enamasti spetsiifilise DNA detekteerimise meetodeid (nukleiinhapete hübridisatsioon, PCR). 2. Geenide kaardistamine kasutades kromosomaalseid ümberkorraldusi. Hübriidsete rakkude analüüs
Oluline on vaid see, et hübriidses rakus konkreetne geen avalduks ning et ta oleks eristatav hiire vastavast geeniproduktist. Näiteks UMP kinaasi geen lokaliseeriti esimesse kromosoomi. Inimese ja hiire UMP kinaase on võimalik eristada geelelektroforeesiga. Valkude aminohappelises järjestuses on mõned erinevused ja see kajastub nende ensüümide erinevas liikuvuses geelelektroforeesil. Kui analüüsiti erinevaid hübriidseid rakuliine, siis oli inimese UMP kinaas alati esindatud ainult nende hübriidide korral, mis sisaldasid esimest inimese kromosoomi. Tänapäeval kasutatakse inimese geenide tuvastamiseks hübriidsetest rakkudest enamasti spetsiifilise DNA detekteerimise meetodeid (nukleiinhapete hübridisatsioon, PCR). 2. Geenide kaardistamine kasutades kromosomaalseid ümberkorraldusi. Hübriidsete rakkude analüüs
annaabi.ee 
