järgi) 3. Kuidas töötab fluorestsentsmikroskoop? Ergastav valgus juhitakse läbi filtri uuritava objektini. Filter laseb läbi ainult kindla lainepikkusega valgust, mis on sobiv fluorokroomi ergastamiseks. Emiteeritud valgus sorteeritakse palju tugevamast ergastavast valgusest teise filtri abil. 4. Nimeta erinevaid võimalusi rakukomponentide märgistamiseks fluorokroomidega? Fluorestseeruvad värvid: Difundeeruvad rakku ja seostuvad märklauaga. Näiteks DNA värvid propiidiumjodiid, Hoest, DAPI jt. Immuunofluorestsents: Kasutatakse fluorestseeruva märgisega (FITC, Alexa, Cy, jne.) konjugeeritud antikehasid. Enamasti tehakse kahekihiline reaktsioon, esmalt kasutatakse uuritava valgu vastaseid primaarseid antikehasid ja seejärel fluorokroomiga konjugeeritud sekundaarseid antikehi, mis seostuvad primaarse antikeha konstantsete regioonidega. Fluorestseeruvad valgud: Selleks ekspresseeritakse rakkudes uuritava valgu ja fluorestseeruva valgu liitvalku
Veetustamine, rasve eemaldamine, parafiini sisestamine, deparafiniseerimine. VÄRVAINED! - Hematoksüliin aluseline värv, mis värvib rakkudes happelisi piirkondi (DNA, RNA) - Eosiin on fluorestseiini derivaat. Happeline värv, mis värvib rakus aluselisi piirkondi (tsütoplasma). - Trüpaansinine happeline värv, mis läbib surnud rakkude kahjustunud plasmamembraani ning värvib tsütoplasma valke. - Propiidiumjodiid ja etiidiumbromiid pos laetud fluorestseeruvad ained, mis läbivad surnud rakkude kahjustunud plasmamembraani ja värvivad nukleiinhappeid (DNA, RNA). Seostuvad aluspaaride vahele, mille järel nende fluorestsents tõuseb ligi 30 korda. - DAPI DNA - Hoechst ka DAPI värvivad surnud ja elus rakke, Hoechst rohkem.
Ergastamiseks vajaliku kiirguse lainepikkus on alati lühem, kui emiteeritav kiirgus. Sinise valgusega ergastades saame rohelise fluorestsentsi ja rohelise valgusega ergastades saame punase fluorestsensi. Iga fluorokroomi iseloomustavad neeldumis- ja emissioonispektrid. 142. Enamus molekule rakus ei fluorestseeru ja seetõttu kasutatakse fluorestseeruvaid märgiseid. Fluorestseeruvad värvid – diffundeeruvad rakku ja seostuvad märklauaga. N. DNA värvid propiidiumjodiid, Hoechst, DAPI jt Immuunofluorestsents – kasutatakse fluorestseeruva märgisega (FITC, Alexa, Cy jt) konjugeeritud antikehasid. 143. Enamasti tehakse kahekihiline reaktsioon, asmalt kasutatakse uuritava valgu vastaseid primaarseid antikehasid ja seejärel fluorokroomiga konjugeeritud sekundaarseid antikehi, mis seostuvad primaarse antikeha konstantsete regioonidega. See võimaldab signaali amplifitseerimist. 144. 145. Esimene päev – rakkude fikseerimine 1
Faaskontrastmikroskoobi töö põhimõte. Valguslaine faas muutub kui valgus läbib elusa raku Mikrotoomi töö põhimõte. Fluorestsentsmikroskoobi töö põhimõte. Fluorestseeruvate värvide ergastus ja emissiooni lainepikkuste erinevus. Elavhõbeda lamp ergastab kiirguse Ergastuse lainepikkus on alati kõrgem kui emissiooni lainepikkus Tsütoloogias kasutatavad värvid hematoksüliin, eosiin ja trüpaansinine. Fluorestseeruvad värvid propiidiumjodiid ja etiidiumbromiid. Hematoksüliin(happeline piirkond DNA, RNA), eosiin (aluseline- tsütoplasma), trüptaansinine- happeline värv,läbib surnud rakkude kahjustunud plasmamebranne javärvib tsütoplasma valke Propiidiumjodiid ja etiidiumbromiid-positiivselt laetud fluorestseeruvad ained, mis läbivad surnud rakkude kahjustatud plasmamembraani ning värvivad nukleiinhappeid (DNA, RNA). Seostuvad aluspaaride vahele, mille järel nende fluorestsents tõuseb ligi 30 korda. Neeldumis
Ergastamiseks vajaliku kiirguse lainepikkus on alati lühem, kui emiteeritav kiirgus. Sinise valgusega ergastades saame rohelise fluorestsentsi ja rohelise valgusega ergastades saame punase fluorestsensi. Iga fluorokroomi iseloomustavad neeldumis- ja emissioonispektrid. Enamus molekule rakus ei fluorestseeru ja seetõttu kasutatakse fluorestseeruvaid märgiseid. • Fluorestseeruvad värvid – diffundeeruvad rakku ja seostuvad märklauaga. N. DNA värvid propiidiumjodiid, Hoechst, DAPI jt • Immuunofluorestsents – kasutatakse fluorestseeruva märgisega (FITC, Alexa, Cy jt) konjugeeritud antikehasid. Enamasti tehakse kahekihiline reaktsioon, esmalt kasutatakse uuritava valgu vastaseid primaarseid antikehasid ja seejärel fluorokroomiga konjugeeritud sekundaarseid antikehi, mis seostuvad primaarse antikeha konstantsete regioonidega. See võimaldab signaali amplifitseerimist, sest ühe primaarse antikehaga saab seostuda mitu sekundaarset antikeha.
annaabi.ee 
