suure läbimõõduga, sest ikka olid väiksed vead pipeteerimisel. 17. 18. Polümeraasi ahelreaktsiooni (PCRi) teostamine 19. PCRi kasutatakse valitud DNA lõigu paljunadamiseks. Väga tähtis moment reaktsiooni teostamisel on õigete praimerite valimine ning reaktsioonitingimuste kindel täitmine. PCR reaktsioon toimub kolme-etapiliselt: DNA ahelate denatureerimine, praimerite seondumine DNA ahelatega ning DNA süntees. 20. Oma töös kasutasin Reverse (vastassuunilise) praimerina SV-40 poly A, Forward (pärisuunalise) praimerina EGFP-3-170, ning plasmiidina pEGFP-FoxO3a-wt. Oodatav produkti pikkus – 2400 aluspaari. 21. Töö käik: 1. Pipeteerisin kokku PCRi reaktsioonisegu (20μl): 11,3 μl vett 2 μl 10x polümeraasi puhvrit – tagab vajalikud reaktsioonitingimused, nagu pH, soolade kontsentratsioon jt μl 25 mM MgCl2 (lõppkonts. 2,5 mM) – Mg2+ ioonid on vajalikud polümeraasi töötamiseks
on suurem, kui vektor võib vastu võtta. Kasutatakse randoomset lõikamist; ~20kb) Esineb mitu varianti cDNA sünteesimiseks: 1. cDNA sünteesitakse mRNA järgi, mille otsas on Polü-A-saba, mille praimeriks on polü-T oligonukleatiidne järjestus. Süntees toimub 5 3 suunas. Protsessi viib läbi revertaas dNTP olemasolul. Aluselises keskkonnas ühe ahelalise DNA ots keerab ja mängib rolli praimerina, sünteesitakse teist ahelat. Seda pööret lõikab ära S1 nukleaas. Lõpuks on kaheahelaline cDNA. 2. Kui esineb DNA:RNA kompleks, selle kompleksi tunneb ära ensüüm Rnase H, mis lõhustab RNA juppideks. Need juppid mängivad rolli praimeritena, mille abil sünteesitakse teist DNA ahelat, mille teostab DNA polümeraas I. Tekkinud teise ahela juppid liidab omavahel DNA ligaas. 3. Printsiip on sama, kui eelmisel meetodil Rnase H olemasolul, kuid lõppu lisatakse adaptor
Sama retseptorit kasutavad Coxsackie B viirused. Mõned adenoviirused kasutavad ka MHC I molekule. Viirus lüüsib endosoomi, kapsiid viib DNA tuuma, pentoni ja kiu valgud on rakule toksilised, inhibeerivad makromolekulide sünteesi. Viiruse DNA polümeraasi süntees aktiveerib hiliste geenide sünteesi. Paljud mRNAd kasutavad sama promooterit ja algjärjestust, saadakse erinevate intronite splaissingul. DNA replikatsioon toimub tuumas, vahendab viiruse kodeeritud DNA polümeraas, praimerina kasutatakse terminaalset proteiini koos seostunud tsütosiinmonofosfaadiga. Hiliste geenide transkriptsioon algab pärast DNA replikatsiooni. Kapsiidivalgud toodetakse tsütoplasmas, transporditakse kokkupanekuks tuuma. Algselt pannakse kokku tühi kapsiid, millesse sisestatakse viiruse DNA ja valgud. Replikatsioon on vigaderohke, tekib üks infektsioosne partikkel 11…2300 virioni kohta. DNA, valgud ja defektsed partiklid
Genoomi komponent A kodeerib polüproteiini, mis lõigatakse kiiresti VP2a- (VP2 eelvalk, 50 kDa), VP4- ja VP3-valkudeks. Viiruse proteaasiks on VP4, kuid on tõenäoline, et VP2a lõplikuks protsessinguks (VP2 moodustumine, toimub vahetult enne virionide moodustumist või juba moodustunud virionides) on vajalik ka raku proteaaside osalus. Replikatsioon toimub arvatavasti moodustunud subviraalsetes partiklites. On oletatud, et VP1 võib toimida negatiivsete RNA ahelate sünteesil praimerina. 2. SUGUKOND PARTITIVIRIDAE Vaatamata väga laiale levikule avastati esimene krüptoviirus (beet cryptic virus (BCV)) alles 1969 aastal. Osalt seisneb selle põhjus selles, et krüptoviirused on väga vähese patogeensusega viirused - taimedes on krüptoviiruse kontsentratsioon väga madal ja nakkusega ei kaasne märgatavaid sümptoome. Krüptoviiruste süstemaatika muutub pidevalt, praegu ühendatakse nad ühte sugukonda sarnaste seeneviirustega (Partitivirus, Chrysovirus)
tunnevad ära sellest järjestusest ülespoole jäävaid alasid. Polü(A) järjestused 3' otsas Bakterirakus on kirjeldatud 2 polü(A) polümeraasi PAP I ja hiljuti PAP II. PAP I on pcnB geeni produkt. PAP I mõju RNA stabiilsusele kirjeldati esmakordselt RNA I puhul. RNA I on ColE1 plasmiidide replikatsioonil repressorina toimiv antisens-RNA, mis interakteerub plasmiidi replikatsiooni initsiatsioonil praimerina toimiva RNA-ga. PAP I-defektsetes mutantides on kirjeldatud mitmete mRNA-d stabiliseerumist: lpp - lipovalk ompA - välismembraani valk A trxA - tioredoksiin rpsO - ribosoomi valk S15 3' otsas polü(A)-järjestust sisaldavad RNA molekulid on PNPaasi ja RNaas II poolt paremini atakeeritavad, kuna polü(A)-järjestus võib olla nende nukleaaside kinnitumiskohaks muidu vahetult 3' otsas sekundaarstruktuuri sisaldavatele mRNA-dele
annaabi.ee 
