cDNA. 2. Kui esineb DNA:RNA kompleks, selle kompleksi tunneb ära ensüüm Rnase H, mis lõhustab RNA juppideks. Need juppid mängivad rolli praimeritena, mille abil sünteesitakse teist DNA ahelat, mille teostab DNA polümeraas I. Tekkinud teise ahela juppid liidab omavahel DNA ligaas. 3. Printsiip on sama, kui eelmisel meetodil Rnase H olemasolul, kuid lõppu lisatakse adaptor ja kasutatakse geeni spetsiifilise praimeri (4tk), mis sünteesivad kaks juppe. 17. Kirjelda oligonukleotiidide sünteesi kasutades tahke faasi fosforamiidit. Mis toimub erinevates sünteesi etappides? Millised monomeeride rühmad tuleb kaitsta ja miks? Kuidas ja millal kaitsvad rühmad eemaldatakse? Millises etappis on protsess äärmiselt veetundlik ja miks? (1) DMT rühmad lisanduvad 5-otsaga. Toimub fosfordiestersideme moodustamine, mis tekib amiidofosfiitrühmast (DMT kaitsevad OH-
(2) Geeniekspressiooni inhibeerimine Kuigi suure osa geeniteraapia alastest uuringutest moodustavad mittefunktsionaalse geeni asendamisega seotud tööd, on teatud olukordades vajalik töötava geeni(de) (üle) ekspressiooni suunatud inhibeerimine. Seda on võimalik saavutada erinevatel tasemetel.(2) DNA tasemel A) Funktsionaalse geeni inaktivatsioon in situ homoloogilisel rekombinatsioonil vastavalt muteeritud geenikoopiaga.(2) B) Oligonukleotiidide kasutamine. Teatud tingimustel võib DNA moodustada kolmekordse heeliksi. Selleks disainitakse geenispetsiifiline oligonukleotiid, mis paardub kindla sihtmärk geeni järjestusega kaheahelalises DNA-s ja inhibeerib selle geeni transkriptsiooni. Üheahelalise oligonukleotiidi seostumine kaheahelalise DNA-ga toimub nn. Hoogsteen'i paardumise kaudu (vesiniksidemed). Selliste sidemete puhul on kõige stabiilsemad G seondumine G-ga GC aluspaaris ja T seondumine A-ga AT aluspaaris.(2)
Aminoglükosiidid (gentamütsiin, kanamütsiin, neomütsiin) toime seisneb seondumises bakteri 16S rRNA-le, millega kaasnevad vead koodi lugemises mRNA-lt ning seeläbi bakteri eluliselt oluliste valkude sünteesi pärssimise või mutantsete valkude akkumulatsioonis bakteri membraanis. TUlemusena memrbaani barjäärifunktsioon häirub ning rakk lüüsub. EI seostu inimese 18S- rRNA-le, siis on toime selektiivne. mRNA kaudu toimivad ravimid Antisenss ravimid seisnevad oligonukleotiidide kasutamises mRNA translatsiooni takistamiseks. Probleemiks on asjaolu, et mRNA on suur molekul, millel on sek ja terts struktuur - raske leida järjestuslõike, mis on eksponeeritud, lisaks sellele oligonukleotiidi viimine rakku. Potentsiaal on suur. Esimene tuli turule 1992.a papilloomiviiruse põhjustatud genitaaltüügaste raviks. Nukleosiiditüüpi ravimid Ei ole algselt aktiivsed, kui peale fosforüleerimist trifosfaadiks võib inhibeerida pöördtranskriptaasi ning viiruse DNA sünteesi
LIISI KINK 7 VIROLOOGIA ca. 850 koopiat oligoadenülaate (2-20 A jääki), mis on samuti sünteesitud viiruse transkriptaasi poolt. Oligonukleotiidide asukoht ja funktsioonid virionides on ebaselged (teada on see, et core- struktuuris neid ei leidu). 3.1.2. Genoom Reoviiruste genoomne dsRNA kujutab endast paremale keerduvat kaksikspiraali, milles ühe pöörde kohta tuleb 10 bp. Reoviiruste genoom koosneb kümnest lineaarsest dsRNA segmendist, mis suuruse järgi jagatakse kolme klassi: L, ca 3900 bp; M, ca 2250 bp; S, ca 1300 bp. Igas virionis paikneb täielik, 10-st individuaalsest genoomsest segmendist (L1, L2, L3, M1, M2,
Viimase aastakümne olulisem läbimurre molekulaarbioloogia metodoloogias Miks esineb vajadus kiipide järele? 1.Uurimaks genoomi mutatsioonide osas mitmetes geenides 2.Uurimaks genoomi SNP-de osas tuvastamaks aheldatust 3.Uurimaks toiduaineid potensiaalsete patogeenide tuvastamiseks 4. Transkripti olemasolu ja koopianumbrite leidmiseks kas genoomses DNA-s või transkribeeritud RNA Mikrokiipide tehnoloogiad: Esineb kaks põhilist mikrokiibi valmistamise tehnoloogiat mis mõnevõrra kattuvad: 1. Oligonukleotiidide süntees in situ kiibil endal: n. Affymetrix® Gene Chips (oligo- v6i geenifragmendid "ESTd", n.n. cDNA kiibid) Affymetrix Gene Chip TM: -Valmistatakse tuhandete lühikeste oligonukletiidide in situ sünteesi teel klaasmaatriksil -Kiibil vastab 16-20 nukleotiidine ahel ühele kindlale geenile -Igale oligole kiibil vastab veel teine, mis erineb vaid ühe nukleotiidasenduse poolest -Võrreldakse proovi intensiivsust kahe partneroligo vahel -Mõõdetakse geeniekspressiooni absoluutset taset 2
kandjale, tekib kiip. Praimer peab PCRi produktile kinnituma. Lisatakse DNA Pol ja didesoksünukleotiid, mis blokeerib Pol-reaktsiooni. See nukleotiid on florokroomiga märgistatud, ekstensioon 1 nukleotiidi võrra ja pärast konfokaalse skänneriga loetakse kiipi ja saadakse teada, kus tuleb värv esile. 2. DNA-Pol põhised pürosekveneerimistehnikad: väga kiire ja võimas. 1. Klassikaline oligonukleotiidide kiip, millel on erinevad oligonukleotiidi, millel 1 positsioonis on erinev nukleotiid. Ja meid huvitav produkt hübridiseerub ainult ühele neist ja annab fluorestseeruva signaali. Sekveneeritakse väga lühikesi DNA ahelaid, tavaliselt tehakse 2 aluspaari. Oluline on see, et proov võib olla väga lahja. Põhimõte on see, et kui polümeraas liidab mingi nukleotiidi DNA ahelale ja pürofosfaat liitub?
annaabi.ee 
