Mureksiid ehk ammoonium purpuraat on indikaator tumesinise värvusega mida lisatakse komplekslahusesse, et värvuse muutust märgata. Tiitrimise reaktsioon kulgeb järgmiselt: Vaba triloon B + 2CuSO4 Cu(II)-triloon B kompleks + 2Na2SO4 Tiitrimiseks kulunud vasksulfaadi lahuse hulga järgi leitakse suhkrute kontsentratsioon reaktsioonisegus kasutades kalibreerimissirget mis on eelnevalt valmist tehtud. Ensüümi aktiivsuse ühik on mikrokatal (µkat). Üks mikrokatal võrdub 1 sekundi jooksul tehtud 1 mikromool produkti 30 kraadi celsiuse järgi. TÖÖ KÄIGUD Töö käigud koosnevad kolmest osast: ensüümipreparaadi valmistamine, ensüümireaktsiooni läbiviimine ja tiitrimine ehk taandatud suhkru kontsentratsiooni määramine. Vajalikud töövahendid, ained ja nende kogused on töökäigus ära märgitud. 1. Ensüümpreparaadi valmistamine Vajalikud töövahendid
vasksulfaadi lahust. Tiitrimise käigus komplekseerub vabanenud triloon B uuesti Cu(II)- ioonidega ja kompleksi taastekkimist võib täheldada lahusesse lisatud indikaatori mureksiidi värvuse muutumise järgi. Tiitrimisel: Tiitrimiseks kulunud lahuse hulga järgi leitakse kaliibrimissirgelt taandavate suhkrute kontsentratsioon reaktsioonisegus. Invertaasi aktiivsus avaldatakse vedela ensüümipreparaadi korral ja tahke ensüümipreparaadi korral. 1 mikrokatal ensüümi aktiivsuse ühik, mille puhul 1 sekudi jooksul juures produtseeritakse 1 mikromool produkti. Töö käik: Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine. · Doseerisin ensüümipreparaati sobiva automaatpipeti abil ja viisin otse lahuse valmistamiseks ettenähtud gradueeritud katseklaasi, kuhu lisasin sobiva lahjendusmäära saavutamiseks vajalik kogus puhvrit. Katseklaasi lisasin 0,5 ml invertiini lahust ja 9,5 ml atsetaati, et saavutada 20 kordne
ja tagab taandavate suhkrute määramiseks vajaliku leeliselise keskkonna. Keemistemperatuuril taandub kompleksis sisalduv Cu(II) suhkrute toimel Cu(I)-ks ja moodustub punase sademena eralduv Cu2O. Reaktsioonil vabaneb vaba triloon-B, mille kogus määratakse tiitrimise teel. Tiitrimiseks kulunud CuSO4 mahu järgi leitakse kaliibrimissirgelt taandavate suhkrute kontsentratsioon reaktsioonisegus. Invertaasi aktiivsus tahke ensüümi puhul avaldatakse mikrokatalites 1 g kohta. 1 mikrokatal on ensüümi aktiivsuse ühik, mille puhul 1 sekundi jooksul 30 °C juures produtseeritakse 1 mikromool produkti (meie töös taandavat suhkrut). Töö käik Töölahuse valmistamine Kasutan töölahuse valmistamiseks tahket invertaasi. Vajan töölahust kontsentratsiooniga 2 mg/ml. 5 ml töölahuse valmistamiseks vajan seega 10 mg ehk 0,01 g invertaasi. Kaalun ensüümi analüütilisel kaalul; invertaasi kaalutiseks on 0,0103 g. Viin invertaasi ilma kadudeta gradueeritud
See reaktiiv täidab vaadeldava meetodi puhul kahesugust rolli: · tänu tugevalt aluselisele reaktsioonile toimib ta invertaasile, mille pHopt 4,8, inaktiveerivalt ja lõpetab ensüümireaktsiooni, · tagab taandavate suhkrute määramiseks vajaliku leeliselise keskkonna ja vask(II)- triloon B kompleksi. 22 8. Selgitage, mida tähendab invertaasi preparaadi aktiivsus 85 kat/ml sisuliselt? 1 mikrokatal (1 kat) on ensüümi aktiivsuse ühik, mille puhul 1 sekundi jooksul 30 ºC juures produtseeritakse 1 mikromool produkti (1 mol/s), st antud juhul 1 mol taandavat suhkrut. 9. Kuidas tuleb toimida, et valmistada tahkest invertaasi preparaadist 5,0 ml lahust, milles ensüümi kontsentratsioon on 4,0 mg/ml? 10. Kasutasite töös 7%-list sahharoosi lahust. Milline on sellise sahharoosi lahuse molaarne kontsentratsioon (Mr = 342)? Millises suhtes (suurem/ väiksem/võrdne)on see invertaasi Km
lahusesse lisatud indikaatori mureksiidi värvuse muutumise järgi. Tiitrimisel toimuv reaktsioon on järgmine: Tiitrimiseks kulunud CuSO4 lahuse hulga järgi leitakse varem koostatud kaliibrimissirgelt taandavate suhkrute kontsentratsioon reaktsioonisegus. Invertaasi aktiivsus avaldatakse vedela ensüümipreparaadi korral mikrokatalites ensüümilahuse 1ml kohta (µkat/ml), tahke preparaadi puhul mikrokatalites 1g kohta (µkat/g). Meenutame, et 1 mikrokatal (1 µkat) on ensüümi aktiivsuse ühik, mille puhul 1 sekundi jooksul 30 ºC juures produtseeritakse 1 mikromool produkti (1 µmol/s), st antud juhul 1 µmol taandavat suhkrut. Töö käik Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine Vajalik kogus sobiva ensüümi kontsentratsiooniga lahust (nn töölahus) valmistatakse praktikumi juhendaja näpunäidetele järgi. Lahustina kasutatakse atsetaatpuhvrit pH väärtusega 4,8
annaabi.ee 
