TE, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1 mM EDTA-Na2. E.coli DH5 alfa kompetentsed rakud (valmistamist vaata lisast) Steriilne LB (lysogeny broth) sööde (koostis 1 liitri lahuse kohta , 10 g trüptooni, 5 g pärmi ekstrakti ja 5 g NaCl) agar Ampitsilliini (Amp) vesilahus, 100 mg/ml IPTG (isopropüültio-beta-D-galaktosiid), 0,5 M vesilahus X-gal (5-bromo-4-kloro-3-indolüül-beta-D-galaktosiid), 20 mg/ml 70% Etanool. Töö käik: (1) Transformatsiooniks lahjenda saadud ligeerimissegu (6 l) TE-ga 10-30 korda (1 osa ligeerimissegu ja 9-29 osa TE-d), sega korralikult ja pipeteeri 10 l lahjendatud segu uude katseklaasi. Võtsin 3 l ligeerimissegu ja 6 l TE-d (tegin 3-kordse lahjenduse). (2) Transformatsioon: 10 l ligeeritud DNA lahjendust 9 l 3-kordset lahjendust + 20 l E.coli DH5 alfa kompetentseid rakke (hoitakse 0 oC juures) Paiguta tuub jääle. Sega ettevaatlikult (näpuga), kompetentsed rakud on õrnad! Inkubeeri 30 min jääl, vahete-vahel segades.
TE, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1 mM EDTA-Na2. E.coli DH5 alfa kompetentsed rakud (valmistamist vaata lisast) Steriilne LB (lysogeny broth) sööde (koostis 1 liitri lahuse kohta , 10 g trüptooni, 5 g pärmi ekstrakti ja 5 g NaCl) agar Ampitsilliini (Amp) vesilahus, 100 mg/ml IPTG (isopropüültio-beta-D-galaktosiid), 0,5 M vesilahus X-gal (5-bromo-4-kloro-3-indolüül-beta-D-galaktosiid), 20 mg/ml 70% Etanool. Töö käik: (1) Transformatsiooniks lahjenda saadud ligeerimissegu (6 l) TE-ga 20 korda (1 osa ligeerimissegu ja 9-29 osa TE-d), sega korralikult ja pipeteeri 10 l lahjendatud segu uude katseklaasi. 6*20-6114 l TE. (2) Transformatsioon: 10 l ligeeritud DNA lahjendust + 20 l E.coli DH5 alfa kompetentseid rakke (hoitakse 0 oC juures) (lahus peab kogu aeg olema külmas, kuna tegemist on elav rakkudega.) Paiguta tuub jääle. Sega ettevaatlikult (näpuga), kompetentsed rakud on õrnad! Inkubeeri 30 min jääl, vahete-vahel segades.
mis värvib indigosiniseks terve koloonia. Kui lacZ operoni sisestada insert, siis see rikub (suure tõenäosusega) lacZ operoni lugemisraami, -galaktosidaasi ei ekspresseerita, eelkirjeldatud protsessi ei toimu ning kolooniad jäävad valged. See võimaldab vaatluse teel eristada kolooniaid, kus insert on plasmiidi sisenenud, ja kolooniaid, kus on vaid tühi plasmiid. e) Ligeerimisprotokoll: 1. Pipeteerida ligeerimissegu (kokku 5 l): 1 l puhastatud PCR produkti 1 l plasmiidi (9ng/ l) 0,5 l 10x ligeerimispuhvrit 0,5 l e. 5 ühikut T4 DNA ligaasi (5 U/l)(hoida jääl või külmakehas) 2 l Milli-Q vett 2. Homogeniseerida lahus pipeteerimise või vortexi teel (kasutasin pipeteerimist). 3. Vajadusel tsentriguugida segu põhja (kuna kogu ligeerimissegu pipeteerisin põhja ühte tilka kokku ning vortexit ei kasutanud, polnud vajadust
ning ka lacZ operooni, mis annab bakterile lisatoitumisallika, kuna kodeerib β-galaktosidaasi. β-galaktosidaas lõhub β1-4 glükosiidsidet ja erinevaid substraate ette söötes saame kindlaks teha, millised meie kasutatud bakterikoloonuatest sisaldavad tühja plasmiidi ja millistel on insert seda ensüümi kodeeriva järjestuse „ära rikkunud“. 47. Ligeerimiseks tuleb pipeteerida kokku ligeerimissegu (5 μl), segada pipeti või vorteksi abil, vajadusel fuugida ning jäta ligeerimiseks järgmise päevani +4 °C juures. Ligeerimissegu: 1 μl puhastatud PCRi produkti 1 μl pSTBlue-1 vektorit (9 ng/μl) 0,5 μl 10x puhvrit 1 μl T4 DNA ligaasi (sünteesib fosfodiester sidemeid) 1,5 μl MQ vett 48. 49.Transformeerimine 50. Eesmärgiks on peale ligeerimist saadud DNA molekuli viimine kompetentsetesse E. Coli
Arvutused: Vektor: 16/1 = 20/x x = 1,25 µl PCR produkt: 150ng/10µl=15ng/µl PCR vektrori suhe peab olema 3:1. Ehk PCR võtame 3*1,25*3,7 µl 10x puhver: 10/10 = 1 Ligaas: 5U/ µl tahame saada 2,5U ehk võtame 0,5 µl 9 MQ: 10-1,25-3,75-1-0,5 = 3,5 Töö käik: Pipeteerin kokku ligeerimissegu Jälgin et lahus saaks homogeenseks Tsentrifuugin Jätan üleöö ligeerima +4 kraadi juurde. Millise konstrukti oma töö käigus kloneerisin? Ligeerisin sellise konstrukti, kus bSTBlue-1 vektoris EcoRV saidis on minu insert ehk DST geen. Milleks kasutasime kloneerimisel pSTBlue-1 vektorit? Mis teeb selle eriliseks? See on meie vahevektor ja see on väga hea kuna võimaldab sini-valge skriinimist
annaabi.ee 
