Antud töös kasutatakse peatatud reaktsiooni meetodit, kus reaktsioon lõpetatakse NaOH lisamise teel. Tekkinud produkti hulga/kontsentratsiooni arvutamiseks määratakse optiline tihedus lainepikkusel 410 nm. 1)ENSÜÜMI KONTSENTRATSIOONI (E) MÕJU REAKTSIOONI KIIRUSELE (v) Selles katses varieerisime fosfataasi kontsentratsiooni, teised parameetrid (substraadi kontsentratsioon, pH ja temperatuur) hoidsime konstantsetena. 1) Segasime kokku puhverlahuse, H2O ja pNPP ning inkubeerisime 2-3 minutit toatemperatuuril 2) Lisasime segule ensüümi ja inkubeerisime toatemperatuuril 15 minutit 3) Peatasime reaktsiooni 600 µl 0.1 M NaOH lisamisega 4) Määrasime optilise tiheduse 405 nm juures, arvutasin selle järgi produkti kontsentratsiooni ja reaktsiooni kiiruse (v). Selleks kasutasin korrigeeritud optilisi tihedusi (lahutasin optilisest tihedusest ilma ensüümita lahuse optilise tiheduse 0,05). Kasutasin valemit A=*C*l, kust avaldasin C=A/(*l). =
vesi, 4x kontsentreeriva geeli puhver SDS-i 10% lahus akrüülamiid/bisakrüülamiidi lahus Viimastena lisasime TEMEDit tõmbe all ja APSi, mis katalüüsivad polümerisatsioonireaktsiooni. 4. Valasime kontsentreerivat geeli lahutava (alumise) geeli peale ning panime paika kammi (ettevaatlikult). Jätsime geeli polümeriseeruma. 5. Sellel ajal valmistasime proovid ette. Segasime omavahel valgulahust ja 2x laadimispuhvrit (15 µl : 15 µl). Inkubeerisime denatureerimiseks 95oC juures 5 minutit. Jahutasime jäävannis. 6. Proovide jahutamise ajal asetasime geel foreesiaparaati. Täitsime puhvrikambrid jooksupuhvriga (0,25 M TRIS, 1,92 M glütsiin, 0,1% SDS, pH 8,3), eemaldasime ettevaatlikult kammi ning pesime moodustunud geelitaskutest välja polümeriseerumata geelilahuse jäägid (kasutades jooksupuhvrit ja süstalt). Forees 1. Kandsime ettevalmistatud valguproove ettevaatlikult geelitaskutesse (20 l)
Sarcina sp. Gram positiivsed kooslusi moodustavad bakterid või kokid Etapp2. Mikroorganismide kasvukiiruse sõltuvuse uurimine 1. Temperatuurist: · võetsime tardsöötmetel eelkasvatatud organisme ehk 2 bakterit ja pärmi · tegime väljakülvid joonkülvi meetodil Bakterid: 4 tassi PCA-söötmega Pärm: 4 tassi Malt agariga. · inkubeerisime järgmistel temperatuuridel: külmutuskapis +5 ºC, toatemperatuuril ~22ºC; termostaadis +35 ºC ja termostaadis +50 ºC. · umbes iga 48 järel märkisime üles tassidel toimunud muutused Saccharomyce Pseudomonas Bacillus sp Ps 42 s cerevisiae sp 105 +5°C +20°C +35°C +50°C +5 °C +20°C +35°C +50°C Külvi skeem 2
laadimispuhvri) eppendorfis. 1. Trüpsin 23,8 kDa 2. EPGluC 29 kDa 3. Laktaat dehüdrogenaas 35 kDa 4. HRP 44 kDa 5. Ovalbumiin 44,3 kDa 6. BSA 66,3 kDa 7. Tundmatu valk X kDa 2. Inkubeerisime denatureerimiseks 95oC juures 5 minutit. 3. Jahutasime valguproovid jäävannis. 4. Raputasime eppendorvid, et saada valgutilgad põhjale. Foreesiaparati asetamine: Proovide jahutamise ajal asetsime geel foreesiaparaati. Seleks täidsime puhvrikambrid jooksupuhvriga (0,25 M TRIS, 1,92 M glütsiin, 0,1% SDS, pH 8,3) ning eemaldasime kammi. Forees: 1. Igasse taskusse kandsime 20 µl valguproovi. Viimasse taskusse panime 3 µl foreesredeli -
ja inkubeerida 10-15 minutit toatemperatuuril. Selles etapis tekivad DNA ja transfektsioonireagendi PEI kompleksid, lahus muutub häguseks. 4. Tõsta katteklaasid steriilsete pintsettide abil 24-augulise plaadi kahte auku. 5. Pipeteerida transfektsioonisegud klaasidele. Aja kokkuhoiu mõttes jätsime meie ära tsentrifuugimise ning pipeteerisime transfektsioonisegu kohe klaasile ning alles seejärel inkubeerisime 15 minutit. Rakkude külvamine 24-augulisele plaadile 6. Rakkude vaatlemine mikroskoobis. Rakkude tihedus umbes 100% 7. Rakkudelt imeda vaakumiga sööde, pesta 1 ml PBSiga , PBS ära imeda. 8. Lisada trüpsiin-EDTA lahust 0,2 ml, inkubeerida mitte rohkem kui 5min. 9. Lisada 1ml söödet (DMEM + 10% FBS NB! antibiootikumideta), suspendeeri rakud 1ml automaatpipetiga tassi küljest lahti. 10. Teha söötmega sobiv lahjendus, et rakkude lõpptihedus 24-augulisel plaadil oleks 33,3%.
annaabi.ee 
