10 µl Elueerimispuhver Madala soolasisaldusega aluseline solvent, et DNA rehüdreeriga ning räni küljest vabastada. Arvutused: 0,1g geeli kohta 300µl. 1,5x300=450µl Töö käik: Lõikan skalpelliga geelist enda fragmendi välja. (0,15g) Lisan ADB puhvri geelile. Inkubeerime 55kraadi juures 5minutit, kuni geel on täielikult sulanud. Pipeteerin kogu koguse ränikolonni. Tsentrifuugin – DNA jääb räni külge ja ülejäänud puhvri viskan ära. Pipeteerin peale 200 µl pesupuhvrit, tsentrifuugin ja kordan. Tõstan kolonni puhtasse 1,5ml tuubi. Elueerin DNA kolonnist elueerimispuhvri abil. Inkubeerin paar minutit laua peal Tsentrifuugin 1 minuti. Seejärel on tuubi põhjas elueerinud PCRi produkt
3% BSA , 0,05% TBS/Tween-20 lahusesse (piimalahus) üheks tunniks. · Meie primaarse antikehaga ei sidunud, panime otse sekundaarse. · Peseme membraani 4x5 min TBS/Tweenis · Sekundaarse antikeha sidumine, inkubeerimine ja pesemine 2x TBS/Tween ja 1x TBS. 3. Membraani visualiseerimine. · Tõstame membraani kiledele ja kanname peale substraadi (SuperSignal West mõlemad komponendid 0,5ml) ja inkubeerime 5 min. · Visualiseerime membraani arvutis. Tulemus näitab meile, et kogu meie valk on kondenseerunud ühte piirkonda ja katse oli sooritatud korrektselt. Direct ELISA Direct ELISA puhul sorbeeritakse antigeenid otse plastikule, seejärel seotakse antigeenile külge ensüümiga konjugeeritud antikehad. Immuunreaktsiooni tulemus visualiseeritakse ensüüm-
F L+ L+ 1:10 G L+ L+ 1:50 ja 1x PBS- ga. H L+ L+ 1:10 Plaati blokeerime 1% BSA lahusega PBS/ 0 Tw-s 1.5 tundi ruumitemperatuuril, eemaldame blokeeriva lahuse ja peseme 3x PBS/Tw-ga. Plaadile kanname ensüümiga konjugeeritud antikeha, lahjendus 1:500 (PBS+ 4µl lahust nr.1). Inkubeerime 1.5 tundi 37 kraadi juures. Konjugaadi eemaldame ja peseme 4x PBS/Tw-ga ja 1x PBS-ga. Peroksüdaasi substraadi lahust, ensüümreaktsiooni katalüsaator kantakse süvenditesse . Värvusreaktsiooni mõõdetakse lainepikkusel ƛ450. Tulemus:
· Kanname kõik proovid vastavasse süvenditesse. Süvendisse G kanname PBS ja viiruse (nr.7). · Plaadilt eemaldame mitteseostunud antigeen ja peseme plaate 4x PBS/ Tw-ga ja 1x PBS- ga. · Plaat blokeerime 1% BSA lahusega PBS/ Tw-s 1.5 tundi ruumitemperatuuril, eemaldame blokeeriv lahus ja peseme 3x PBS/Tw-ga. · Plaadile kanname ensüümiga konjugeeritud antikeha, lahjendus 1:500 (PBS+ 4µl lahust nr.1). Inkubeerime 1.5 tundi 37 kraadi juures. Konjugaat eemaldame ja peseme 4x PBS/Tw-ga ja 1x PBS-ga. · Peroksüdaasi substraadi lahus ja ensüümreaktsiooni katalüsaator kanname süvenditesse . Värvusreaktsiooni mõõdetakse lainepikkusel 450. Töö tulemus: ELISA plaat 1 2 A 0,046 0,051 1:10 B 0,050 0,44 1:20 C 0,060 0,059 1:10 D 0,052 0,061 1:10 0
(10) Interpreteeri tulemused (ligeerimise efektiivsus, kolooniate arv, jne.) ja vali üks valge koloonia minipreparatsiooniks (vt. järgmine töö). Need kolooniad tuleb 1,8 ml LB vedelsöötmesse kasvama panna praktikumi-eelsel päeval (kontakteeru ses suhtes juhendajaga). Lisaülesanded: 2.1) Võrdle antud transformatsiooni protokolli (mis on kasutusel GTI Molekulaarbioloogia laboratooriumis) DNA kokaraamatus tooduga. Millised on erinevused? Meie inkubeerime 5min 37 kraadi juures, kokaraamatus 1,5min 42 kraadiga. 2.2) Millisel juhul võib bakterikoloonia sisaldada rekombinantset plasmiid, kuid samas koloonia värvus on ikka sinine. Kuidas määrata, et selles koloonias on rekombinantne plasmiid? Avatud lugemisraam, stop-koodon puudub või kui initsiatsioon algab meie inserdist. Määrata saab restriktsiooniga, kui multikloneerimissaidis on restriktaas SacII. 2.3) Mis juhtub, kui jätta Amp panemata?
annaabi.ee 
