DNA-ga seonduvaid värve. 21. Kuidas on võimalik PCR-iga paljundatud DNAt visualiseerida?- agaroos sulatatakse puhvris->geeli valades pannakse paika geelikamm->tardunud geeli korral kamm eemaldatakse->tekkinud süvenditesse valatakse DNA->Geel valatakse puhvriga üle->DNA koos glütserooli sisaldava värvainega pannakse süvendi põhja-> DNA on negat. Laenguga ja elektri väljas liigub pluss laengu suunas->DNA on värvitu, selle nägemiseks lisatakse sageli etiidiumbromiidi, mis seostub igasuguse DNA-ga->väikesed DNA jupid liiguvad kiiremini kui suured jupid->DNA jupi pikkuse hindamiseks, lisatakse ühte hambasse redel e. kindla pikkusega DNA lõikudest koosnev kontrollsegu 22. Kas DNA on sinist värvi?-EI, värvusetu 23. Miks hakkab DNA elektroforeesil agaroosgeelis liikuma?- elektrivälja mõjul 24. Millise laenguga on DNA?- negatiivse 25. Kas agaroosgeelis liiguvad kiiremini pikad või lühikesed DNA jupid?- lühikesed 26
12. Miks ei või geeli vette teha vaid peab puhvrisse panema? Agaroosgeel peab olema tehtud puhvrisse, sest kui seda jooksutada ka puhvris ja kui geel on tehtud vette, siis Tris puhver tõmbab geelist vee välja. Tagab stabiilse pH. Oluline, sest DNA/RNA laeng sõltub keskkonna pH-st. 13, Miks kasutatakse laadimispuhvrit ja mis on see tavaliselt? DNA proovide kandmisks geelile kasutatakse laadimispuhvrit, mis sisaldab glütserooli. Proov vajub kaevukese põhja. 13. Miks sisaldab puhver ka etiidiumbromiidi? Selleks, et hiljem visualiseerida DNA froees UV-valguses (254 nm). 14. Mis suunas liiguvad geelis molekulid? Liiguvad agaroosgeelis elektrivälja rakendamisel katoodilt anoodile (+). 15. Kui sul on kaks E.colit, mida teed, et teada saada kas RecA on olemas? 1) PCR 2) UV-ga kiiritad UV-ga kiiritad. Kui RecA on olemas, siis aktiveerib see RecA proteolüütilist stimuleeriva fn-i. RecA aktiveerib LexA autokatalüütilise proteolüüsi ja LexA
Punktis 7 pestakse lahust 70% etanooliga. 3.2) Kui palju tuleb võtta RNaasA-d, mille algkontsentratsioon on 10 mg/ml, et selle lõppkontsentratsioon oleks 5 ng/l 1 ml-s TE-s? Mitu korda tuleb RNaasi lahjendada? On vaja võtta 1ml RnaasA-d, 2000x. 3.3) Millise laenguga on DNA? Kas geeli ,,hammastega" ots (millesse on kantud DNA) tuleb asetada foreesivanni + või elektroodi poole. DNA on negatiivse laenguga, tuleb asetada eletroodi poole. 3.4) Milleks kasutatakse geelelektroforeesil etiidiumbromiidi (EtBr)? Kuidas EtBr toimib? DNA nähtavaks tegemiseks (EtBr interakteerub lämmastikaluste vahele ning hiljem UV-valguses fluorestseerub), vähendab DNA laengut (DNA muutub pikemaks ja jäigemaks). 3.5) Mitu grammi agaroosi on vaja 40 ml 1,5 % geeli tegemiseks? 80 ml 0,8 % geeli tegemiseks? Et valmistada 40 ml 1.5% geeli on vaja 0,6 g agaroosi ja , et valmistada 80 ml 0,8% geeli on vaja 0,64 g agaroosi.
Mitu korda tuleb RNaasi lahjendada? On vaja võtta 1ml RNaasA-d, et selle lõppkontsentratsioon oleks 5ng/µl 1 ml- s TE- s. Tuleb lahjendada RNaasi 2000 korda. 3.3) Millise laenguga on DNA? Kas geeli ,,hammastega" ots (millesse on kantud DNA) tuleb asetada foreesivanni + või elektroodi poole. DNA on negatiivse laenguga. Geeli ,,hammastega" ots (millesse on kantud DNA) tuleb asetada foreesivanni elektroodi poole. 3.4) Milleks kasutatakse geelelektroforeesil etiidiumbromiidi (EtBr)? Kuidas EtBr toimib? EtBr on vajalik elektroforeesil, et visualiseerida meie tulemused ehk selleks, et elektroforeesi pildil oleks võimalik eristada meie inserdi erinevaid osasid. Veel EtBr aitab otsustada millal on õige aeg fooresi lõpetada. Pärast kui DNA molekul on lahti keerdunud interakteerub EtBr lämmastikaluste vahel ja pärast fluorestseerib UV-kiirgusel. 3.5) Mitu grammi agaroosi on vaja 40 ml 1,5 % geeli tegemiseks? 80 ml 0,8 % geeli tegemiseks? Et valmistada 40 ml 1
Pikkade DNA fragmentide jaoks on TAE lahutusvõime veidi parem kui TBE-l ja lühemaid fragmente lahutab TAE halvemini kui TBE. 72 GEL-LOADING DYE. Segatakse uuritava prooviga enne geelile kandmist, et 1. suurendada proovi tihedust, mis tagab proovi vajumise geelihamba põhja; 2. värvida proov, mis lihtsustab pealekandmist. DNA detekteerimine Nukleiinhapete nähtavaksmuutmine geelil toimub peale foreesi. Selleks kasutatakse • Etiidiumbromiidi (EtBr). EtBr seondub nukleiinhapetega ja fluorestseerub UV valguses (302 nm), muutes DNA nähtavaks. Kuna ilma EtBr-ta geelis on DNA bändid teravamad ja ilusamad, siis võib geeli värvida EtBr-ga peale foreesi. Selleks hoitakse geeli 30-45 min toatemperatuuril foreesipuhvris või destilleeritud vees, kuhu on lisatud EtBr (0,5 µg/ml). Tausta helenduse vähendamiseks võib EtBr-ga värvitud geeli loputada 20 min toatemperatuuril destilleeritud vees.
annaabi.ee 
