Antikeha peab olema 1:2000, seega tuleb lahjendada 2000 korda, 400/2000=0,2 µl. c. Fikseerimine on vajalik, et kinnitada rakud plaadile ning fikseerida antigeenide asukoht rakus, samal ajal säilitades raku natiivne kuju. Neutraliseerimine on vajalik selleks, et fikseerimisel kasutatud ained ei segaks antikehade seondumist ning permeabiliseerimine võimaldab antikehadel rakku siseneda ning pääseda antigeenideni. Blokeerimise eesmärk on takistada antikehade ebaspetsiifilist seondumist nendesse kohtadesse, kuhu igasugused valgud kleepuvad. Primaarse antikehaga inkubeerimisel seondub primaarne antikeha antigeeniga antud juhul tubuliiniga. Inkubeerides sekundaarse antikehaga seonduvad sekundaarsed antikehad primaarse antikehaga. Kahekihiline reaktsioon on vajalik selleks, et poleks vaja iga primaarset antikeha fluorokroomiga konjugeerida, lisaks võimendab see signaali, kuna iga primaarse antikehaga saab seostuda mitu sekundaarset antikeha.
Neutraliseerimine ja permeabiliseerimine: lisada rakkudele 0,5 ml permeabiliseerimislahust (lahustab osaliselt rakumembraanide lipiidid, et antikehad hiljem rakku pääseks), inkubeerida 15 min ning pesta rakke 2 korda 5 minutit (kokku) 1 ml 1x PBSiga. 4. Blokeerimine: lisada rakkudele 0,5 ml blokklahust, jätta seisma +4°C juures. Blokeerimise eesmärk on BSAga katta ära need kohad, kuhu igasugused valgud kleepuvad. Kuna antikehad on ka valgud, siis see etapp takistab antikehade ebaspetsiifilist seondumist. 153. 154. 155. 156. Teine päev – immuunotsütokeemia 1. Inkubatsioon primaarse antikehaga. Valmistada 0,2% BSA-PBS lahus (200 μl): 20 μl 2% BSA lahust + 180 μl 1x PBSi + Mouse anti tubuliin 1:500 0,4 μl, segada. Lisada lahus rakkudele ja inkubeerida 60-90 min toatemperatuuril, mille jooksul primaarne antikeha seondub oma sihtmärgiga. Pärast pesta 3 korda 5 minutit 1 ml PBS-Tweeniga seondumata antikeha eemaldamiseks 2
Neutraliseerimine ja permeabiliseerimine: • lisada rakkudele 0,5 ml permeabiliseerimislahust • inkubeerida 15 min • pesta rakke 2 korda 5 minutit (kokku) 1 ml 1x PBSiga. Blokeerimine: • lisada rakkudele 0,5 ml blokklahust • jätta seisma +4°C juures. Blokeerimise eesmärk on BSAga katta ära need kohad, kuhu igasugused valgud kleepuvad. Kuna antikehad on ka valgud, siis see etapp takistab antikehade ebaspetsiifilist seondumist. Teine päev – immuunotsütokeemia Immuunotsütokeemias kasutatakse valkude detekteerimiseks rakus antikehasid. Rakubioloogias kasutatakse kahte tüüpi antikehasid: monoklonaalsed ja polüklonaalsed. Monoklonaalsed antikehad on toodetud kindla peptiidi vastu, samas kui polüklonaalsed antikehad tunnevad ära ühe valgu mitut piirkonda ehk epitoopi. Epitoop võib olla konformatiivne kui ka liniaarne
asg geenid vastutavad A-signaalmolekulide sünteesi eest. Need erinevad streptomütseetide puhul kirjeldatud A-faktorist. A-signaalmolekulid jaotuvad temperatuuristabiilseks ja temperatuuritundlikuks fraktsiooniks. Temperatuuristabiilne fraktsioon koosneb aminohapetest proliin, türosiin, fenüülalaniin, trüptofaan, leutsiin, isoleutsiin ja alaniin ning polüpeptiididest, mis koosnevad eeskätt just neist aminohapetest. Temperatuuritundlik fraktsioon sisaldab vähemalt kahte ebaspetsiifilist proteaasi. Arvatavasti on ekstratsellulaarsed aminohapped ja lühikesed peptiidid saadud just tänu nendele proteaasidele. Alates teatavast A-signaalmolekulide kontsentratsioonist on diferentseerumine pärsitud. Kui nende kontsentratsioon langeb aga alla kriitilise piiri, indutseeritakse viljakeha arenemine. csg geen kodeerib C-faktorit, milleks on 17 kDa-suurune valk. See valk moduleerib vähemalt 50 rakkude liikumise, agregeerumise ja morfogeneesiga seotud geeni transkriptsiooni
asg geenid vastutavad A-signaalmolekulide sünteesi eest. Need erinevad streptomütseetide puhul kirjeldatud A-faktorist. A-signaalmolekulid jaotuvad temperatuuristabiilseks ja temperatuuritundlikuks fraktsiooniks. Temperatuuristabiilne fraktsioon koosneb aminohapetest proliin, türosiin, fenüülalaniin, trüptofaan, leutsiin, isoleutsiin ja alaniin ning polüpeptiididest, mis koosnevad eeskätt just neist aminohapetest. Temperatuuritundlik fraktsioon sisaldab vähemalt kahte ebaspetsiifilist proteaasi. Arvatavasti on ekstratsellulaarsed aminohapped ja lühikesed peptiidid saadud just tänu nendele proteaasidele. Alates teatavast A-signaalmolekulide kontsentratsioonist on diferentseerumine pärsitud. Kui nende kontsentratsioon langeb aga alla kriitilise piiri, indutseeritakse viljakeha arenemine. csg geen kodeerib C-faktorit, milleks on 17 kDa-suurune valk. See valk moduleerib vähemalt 50 rakkude liikumise, agregeerumise ja morfogeneesiga seotud geeni transkriptsiooni
annaabi.ee 
