k oli antud ja see oli 0,1. Vastavalt valemitele arvutasin: 2 1,8 Vt = * * 31,4 = 79,86cm 3 2 V g = k * Vt = 7,986 V x max = 79,86 - 7,986 = 71,874 71,874 n= = 35,957 36 2 Sain siis, et fraktsioonide üldarvuks tuleb 36. Seejärel eemaldasin kolonni ülaosast üleliigse vedeliku lastes sel voolata mööda kolonni väiksesse keeduklaasi. Kui vedeliku nivoo oli geelisambaga peaaegu samal kõrgusel ( umbes 2mm kõrgemal) siis sulgesin kraani ja doseerisin pipetiga geelisamba pinnale 0,5ml uuritavat proovi. Proov koosnes kolmest komponendist: dekstraansinine, müoglobiin ja DNA-aspartaat. Seejärel keerasin kraani vaikselt tilkuma ja panin sinna alla kolvi. Kui uuritav proov oli geeli imendunud, lisasin natuke juurde puhvrit, seejärel uuesti väikese koguse ja lõpuks lisasin rohkem, et puhvri maht ulatuse kolonni ääreni. Lasin eluaadil kolbi tilkuda seni, kuni esimene värviline riba ( sinine) jõudis kolonni põhjani ja
värvuse muutumise järgi. Tiitrimisel: Tiitrimiseks kulunud lahuse hulga järgi leitakse kaliibrimissirgelt taandavate suhkrute kontsentratsioon reaktsioonisegus. Invertaasi aktiivsus avaldatakse vedela ensüümipreparaadi korral ja tahke ensüümipreparaadi korral. 1 mikrokatal ensüümi aktiivsuse ühik, mille puhul 1 sekudi jooksul juures produtseeritakse 1 mikromool produkti. Töö käik: Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine. · Doseerisin ensüümipreparaati sobiva automaatpipeti abil ja viisin otse lahuse valmistamiseks ettenähtud gradueeritud katseklaasi, kuhu lisasin sobiva lahjendusmäära saavutamiseks vajalik kogus puhvrit. Katseklaasi lisasin 0,5 ml invertiini lahust ja 9,5 ml atsetaati, et saavutada 20 kordne lahjendus. · Katseklaasi sulgesin korgiga ja loksutasin lahust kontsentratsiooni ühtlustamiseks. Ensüümireaktsiooni (sahharoosi hüdrolüüsi) läbiviimine.
nimetatakse kromatogrammiks. Ainete väljumis- ehk elueerumismahtusid näitavad nende fraktsioonide elueerumis-mahud, milles vastava aine kontsentratsioon on kõige kõrgem. Töö käik: Märkisin üles kolonni iseloomustavad suurused. Avasin ettevaatlikult kolonni väljavooluava ja täidise kohal olev voolutuslahusel lasin voolata kolonni kuni vedeliku tase langes täidise pinnani. Samal ajal reguleerisin kolonni voolukiirus umbkaudu kiiruseni 0,7-1,0 ml/min. Segu doseerisin kolonni 0,5 ml. Segu koosneb 2 mg/ml dekstraansinisest; 1,5 mg/ml müoglobiinist ja 0,3 mg/mlDNP-aspartaadist. Kui proov oli liikunud täidisesse lisasin pipeti abil geeli pinnale väikese kogus voolutit ja lasin sellel sisse imbuda. Siis kandsin geeli pinnale suurema kogus voolutuslahust, lisasin seda pidevalt vastavalt vajadusele. Avasin väljavoolu ning hakkasin koguma voolutit, kuni kõige kiiremini liikuv lahuse komponent jõudis kolonni alaossa. Ühendatud fraktsiooni mahu
muutumise järgi. Tiitrimiseks kulunud CuSO4 lahuse hulga järgi leidsin kaliibrimissirgelt taandavate suhkrute kontsentratsiooni reaktsioonisegus. Kõigepealt valmistasin invertaasi lahuse, et hakata määrama seal oleva invertaasi aktiivsust. Selleks mõõtsin vajalikud kogused ja mahud ning et töö tulemus oleks täpne tegutsesin kvantitatiivselt. Seejärel segasin, et moodustuks ühtlane suspensioon. Vedela ensüümpreparaadi doseerisin sobiva pipeti abil. Seejärel valasin katseklaasi reaktsioonisegu ja panin ta vesitermostaati juurde soojenema reaktsiooni soodustamiseks ning 3 koonilisse kolbi komplekslahuse, et need kindlatel aegadel kokku viia. Kokkuviimise hetkel fikseerisin aja, et lahused reageeriksid kindla aja. Kohe pärast reaktsioonisegu läbiloksutamist võtsin sealt 0-proovi, mis iseloomustab sahharoosi hüdrolüüsi alghetkel. 10 minuti möödudes võtsin järgmise proovi, et teha kindlaks hüdrolüüs
Fraktsioonide üldarv n= Vxmax/ 2 n= 91,8/246 katseklaasi Elueerimispuhver: 0,15 M NaCl; 20 mM Tris/HCl; pH= 7,5 Lahutatava segu koostis: dekstraansinine 3 mg/ml, müoglobiin 6 mg/ml, DNP- aspartaat 0,3 mg/ml Segu komponentide lahutamine kolonnis 1. Avasin alumise kraani ja lasin voolutil kolonnist tilkuda väiksesse keeduklaasi kuni vooluti oli mõne mm kõrgusel geeli nivoost, jälgides, et kolonn kuivaks ei jookseks. 2. Sulgesin kolonni väljavooluava ning doseerisin pipetiga geeli pinnale 1 ml uuritavat proovi. 3. Järgmiseks lisasin tilkhaaval voolutit, et proov imenduks geeli, kuid ei lahustuks voolutis. 4. Kui proov oli geeli sisenenud, lisasin suurema koguse voolutit geeli pinnale. 5. Valmistasin ette 40 katseklaasi, kuhu fraktsioone koguda, ning asetasin ühe 100 ml keedu-klaasi väljavooluava alla, avasin kraani. 6. Kuni dekstraansinine lähenes kolonni põhjale, tilkus kolonnist puhas vooluti, mida
suhkruid. Taandavad suhkrud reageerivad tsitraadiga komplekseerunud vaseiooniga. Vaba aldehüüd- või ketorühma (poolatsetaalse või -ketaalse hüdroksüülrühma) toimel vask taandub, andes punase värvusega vask(I)oksiidi, mis lahusest välja sadeneb. Suhkur oksüdeerub reaktsioonil vastavaks happeks. Sarnane reaktsioon toimub ka taandavate suhkrute reaktsioonil Fehlingi lahustega. Töö käik Kahte katseklaasi doseerisin 1 ml sahharoosi lahust. Ühte katseklaasi lisasin 1 tilk konts.HCl. Kuumutasin vesivannil 5 min 80 oC juures. Mõlemale lisasin 2 ml Benedict'i reaktiivi ja segasin. Uuesti soojendasin. Tulemus ja järeldus Pärast Benedict'i reaktiivi lisamist segude värv oli sinine, sest Benedict'i reaktiiv andis sellist värvu. Pärast soojendamist katseklaasis, kus oli HCl tekkis punane sade.
annaabi.ee 
