määramisel. Töövahendid: Analüütiline kaal, 5 ml mõõtekolb, 50 ml katseklaas, 4 kuiva katseklaasi, kell, pipetid, lehtrid, paberfiltrid, spektromeeter, vesitermostaat, kvartskvürett. Töö käik: Valmistatakse uuritava proteaasi lahus ensüümile sobiva pH väärtusega puhvris. Selleks kaalutakse analüütilisel kaalul 0,0051 g ensüümipreparaati, milleks oli alkalaas, ja seejärel viiakse kvantitatiivselt 5 ml mõõtekolbi. Lisatakse väike kogus boraatpuhvrit ja loksutatakse, kuni ensüüm on lahustunud. Seejärel täidetakse kolb puhverlahusega märgini. Võetakse 50 ml mahuga katseklaas, kuhu pipeteeritakse 25 ml sobiva pH väärtusega 2% kaseiini lahust ja asetatakse vesitermostaati 30 oC juures umbes 5-10 minutiks soojenema. Siis võetakse 4 kuiva katseklaasi pipeteeritakse igaühte 3 ml 5% TKÄ lahust. TKÄ-d kasutan, kuna see ühtlasi inaktiveerib ensüümi ja peatab hüdrolüüsireaktsiooni.
trikloroäädikhappega mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide sisalduse määramisel spektrofotomeetrilisel meetodil. Töö käik · Alkalaasi ensüümist valmistati 5ml lahust, kus ensüümi konsentratsioon oli 1,5mg/ml. Selleks kaaluti analüütilisel kaalul kaaluklaasi 5 · 1,5 = 7,5mg = 0,0075g ensüümipreparaati ja viidi see kvantitatiivselt gradueeritud katseklaasi. · Lisati väike kogus boraatpuhvrit (pH = 8,4) ja segati 5 min klaaspulgaga. Seejärel täideti katseklaas 5ml-se mahuni puhverlahusega ja loksutati läbi. · Võeti 50ml mahuga suur katseklaas ning pipeteeriti sinna 25ml 2% kaseiini lahust, mille pH oli regluleeritud ensüümile sobivale väärtusele. Katseklaas varustati korgiga ning asetati 10 minutiks vesitermostaati 30±1C juurde soojenema. · Võeti 4 kuiva katseklaasi ning nummerdati need
Sademe eraldamisel jäävad lahusesse vabad aminohapped ja madalmolekulaarsed peptiidid, mille kontsentratsiooni iseloomustatakse aromaatsete tuumade sisalduse järgi, mis on spektrofotomeetiliselt hõlpsasti detekteeritavad. Saadakse kätte türosiini sisaldus erinevatel aegadel võetud proovidest. Töö käik Alkalaasi preparaadist valmistati boraatpuhvris, mille pH=8,4, lahus, lisades 0,01g alkalaasile 5ml boraatpuhvrit. Lahust segati klaaspulgaga kuni alkalaas lahustus. 50ml katseklaasi pipeteeriti 25ml 2%-list kaseiini lahust ja asetati vesitermostaati 30-kraadi juurde 10 minutiks. Samal ajal valmistati ette 4 katseklaasi, pipeteerides igaühte 3ml TKÄ lahust (5%). Pärast kaseiini soojendamist pipeteeriti kaseiinile juurde 1ml valmistatud alkalaasi töölahust, segu loksutati kiiresti läbi, fikseeriti aeg, võeti kuiva pipetiga 3ml reaktsioonisegu ja asetati katseklaas tagasi termostaati.
trikloroäädikhappega mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide sisalduse määramisel spektrofotomeetrilisel meetodil. Töö käik · Alkalaasi ensüümist valmistati 5ml lahust, kus ensüümi konsentratsioon oli 1,5mg/ml. Selleks kaaluti analüütilisel kaalul kaaluklaasi 5 · 1,5 = 7,5mg = 0,0075g ensüümipreparaati ja viidi see kvantitatiivselt gradueeritud katseklaasi. · Lisati väike kogus boraatpuhvrit (pH = 8,4) ja segati 5 min klaaspulgaga. Seejärel täideti katseklaas 5ml-se mahuni boraatpuhvriga ja loksutati läbi. · Võeti 50ml mahuga katseklaas ning pipeteeriti sinna 25ml 2% kaseiini lahust, mille pH oli regluleeritud ensüümile sobivale väärtusele. Katseklaas kaetakse korgiga ning asetati 10 minutiks vesitermostaati 30±1C juurde soojenema. · Võeti 4 kuiva 20ml katseklaasi ning nummerdati need. Igasse katseklaasi pipeteeriti 3ml 5% TKÄ
järgi türosiini kontsentratsioon kindlatel aegadel reaktsioonisegust võetud proovides. Töö käik Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine · Pidin valmistama 5 mL lahust kontsentratsiooniga 1,5 mg/mL. Minu poolt uuritavaks proteaasi preparaadiks oli Alcalase. Kaalusin analüütilisel kaalul 7,1 mg uuritavat proteaasi ja viisin selle kvantitatiivselt gradueeritud katseklaasi. Järgnevalt lisasin uuritavale ainele boraatpuhvrit (pH=8,4), esialgu väiksema koguse. · Järgnevalt segasin gradueeritud katseklaasi segu 5 minuti vältel, et ensüüm lahustuks. Selgelt lahust seejuures ei tekkinud, sest uurisin tehnilist ensüümipreparaati, mis lisaks ensüümivalkudele sisaldab ka muid valke ja täiteaineid. · Hiljem viisin katseklaasis oleva lahuse sobiva mahuni, milleks oli 5 mL ja lisasin katseklaasile korgi ja loksutasin seda, et ensüümi kontsentratsioon lahuses ühtlustuks.
kindlatel aegadel reaktsioonisegust võetud proovides Töö käik Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine Alkalaasi preparaadist valmistasin ensüümile sobiva pH väärtusega puhvris lahuse. Arvutasin, et 5 ml lahuse valmistamiseks on vaja 10 mg alkalaasi preparaati. Analüütilisel kaalul sain kaalutiseks 10,7 mg. Viisin ensüümipreparaadi kadudeta katseklaasi. Lisasin 5 ml boraatpuhvrit, mille pH oli 8,4. Segasin lahust klaaspulgaga, et ensüüm lahustuks. Kuna preparaadid sisaldavad ka täiteainet, siis selget lahust ei tekkinud. Ensüümireaktsiooni ehk kaseiini hüdrolüüsi läbiviimine 50 ml mahuga katseklaasi pipeteerisin 25 ml 2%-list kaseiini lahust, mille pH oli reguleeritud ensüümile sobivale väärtusele. Katsin klaasi korgiga ja asetasin vesitermostaati 30 °C juurde soojenema. Võtsin 4 kuiva normaalmõõdus katseklaasi ja nummerdasin nad. Igaühte
annaabi.ee 
