2. lineaarne (reaktsiooni komponendid vähenevad, reaktsioon aeglustub). 3. platoo (reaktsioon on lõppenud, enam produkte ei tehta). Siit mõõdab PCR. 9. Mille poolest PCR erineb RT-PCR-st? * Andmete mõõtmiskoht - PCR on mõõdetud lõpp-punktist (platoo). RT PCR mõõdab eksponentsiaalsest faasist – ehk RT-PCR on täpsem → saab kasutada kvantiteerimiseks. * Kiirus – PCR on aeglasem – määratakse produkti agaroosgeelil. RT PCR kvantiteerib DNA- d reaktsiooni käigus – RT-PCR on kiirem. * Tundlikkus - PCRi produkte määratakse EtBr-ga värvunud produktide suuruse alusel. RT PCR määrab produkti kogust fluorestsentsi intensiivsuse alusel. Geeli lahutusvõime (10x erinevust saab tuvastada) on tunduvalt madalam kui fluorestsentsil (2x erinevust). * Tulemuste esitamine – RT PCR-il numbritega, PCR-il ei ole. * Produkti suurus - RT PCR-ga on amplifitseeritud DNA lõigu suurus on väiksem. 5
(3) Lisa PCR tuubi 1 l (1-2 ng) lahjendatud DNA-d. (4) Paiguta tuubid PCRi masinasse ja vali profiil (denaturatsioon 95 oC 30s, hübridisatsioon ehk annealing 50 oC 30s ja ekstensioon 72 oC 1 min; 20 tsüklit). Alusta PCR'i. Tegime 15 tsüklit. (5) Samal ajal valmista 1,2% geel. 40 ml TBE puhvri kohta on vaja kaaluda 0,6 g agaroosi. Valmistamist vaata tööst nr 3. (6) PCRi lõppedes (<1 tund), analüüsi 1/5 saadud produktist agaroosgeelil. Selleks pipeteeri 10 l 1 x TBE foreesipuhvrit (lilla) + 2 l PCR tuubist kokku 12 l, kanda kõik geelile. Geelile lisada kindlasti molekulmassi marker ja kontroll PCR (amplifikatsioon tühjalt pBS SK+ plasmiidilt). 12 Interpreteeri tulemus. Saadud rekombinantsed plasmiidid on valmis inserdi sekveneerimiseks T7 praimeri ja "kit"i abil (järgmises praktikumis). PCRi tulemused
Seejärel kanna saadud kogus 9-10 l kaupa kümnesse PCRi mikrotuubi laiali. (3) Lisa PCR tuubi 1 l (1-2 ng) lahjendatud DNA-d. (4) Paiguta tuubid PCRi masinasse ja vali profiil (denaturatsioon 95 oC 30s, hübridisatsioon ehk annealing 50 oC 30s ja ekstensioon 72 oC 1 min; 20 tsüklit). Alusta PCR'i. (5) Samal ajal valmista ...% geel. 40 ml TBE puhvri kohta on vaja kaaluda ... g agaroosi. Valmistamist vaata tööst nr 3. (6) PCRi lõppedes (<1 tund), analüüsi 1/5 saadud produktist agaroosgeelil. Selleks pipeteeri 10 l 1 x TBE foreesipuhvrit (lilla) + 2 l PCR tuubist kokku 12 l, kanda kõik geelile. Geelile lisada kindlasti molekulmassi marker ja kontroll PCR (amplifikatsioon tühjalt pBS SK+ plasmiidilt). Interpreteeri tulemus. Saadud rekombinantsed plasmiidid on valmis inserdi sekveneerimiseks T7 praimeri ja "kit"i abil (järgmises praktikumis). Restriktsiooni tulemused: Minu minipreparatsioonis tuli välja 2 inserti
kasutada indiviidide või liikide tuvastamiseks. Sinna alla kuuluvad SNP, RFLP, DNA mikrosatelliidid PCR-RFLP - restriktsioonifragmentide pikkuspolümorfism - uuritava piirkonna järjestus on juba väljaselgitatud. Valitakse restriktsiooniensüüm, mis lõikab. Kui mutatsioon esineb, siis DNA ahel ei lõigata katki või just lõigatakse. Esmalt uuritav lõik paljundatakse PCR-iga, seejärel lõigatakse restriktaasiga ja siis lahutatakse fragmentide segu agaroosgeelil. Suurusmarkeri abil määrame, millise suurusega produktid tekkisid, saab määrata selle alusel heterosügootsust või homosügootsust ja ka mutatsioonide esinemist. DNA mikrosatelliidid – DNA tandeemselt korduvad 2-6 ap pikkused järjestused. Korduste arv on indiviiditi erinev. SNP – ühenukleotiidiline polümorfism - DNA järjestuse varieeruvus, mis väljendub ühe nukleotiidi muutumisel genoomis. 83. Milleks kasutatakse põllumajandusloomade aretuses ja
3. STR markerite iseloomustus (korduste tüübid, alleelide tähistamine, alleelide eristamine). · Dinukleotiid · Trinukleotiid · Tetranukleotiid · Pentanukleotiid · Heksanukleotiid Alleele eristatakse pikkuse alusel ehk mõõdetakse DNA juppide pikkusi. Mida suurem on 2 alleeli pikkuse erinevus, seda väiksem võib lahutustundlikkus olla. Näiteks 1 nukleotiidilise erinevuse nägemiseks peab suurem lahutusvõime olema agaroosgeelil paarinukleotiidilist erinevust ei erista. Kordused->kordusühikud->kordusjärjetused. Kordused võivad ka järjetuse siseselt natuke erineda. Korduste arv lookuses on erinev alleelid erinevad teineteisest selle poolest, mitu korda seda kordust seal on. Sellega külgnev ala pole polümorfne ja selle vastu disainitakse praimerid. Kui saame vanematelt täpselt samasugused alleelid samade korduste arvuga, on nad sama lookuse suhtes homosügootsed.
annaabi.ee 
