DNAd ühe minuti jooksul, siis läheks teoreetiliselt sellel aega 2 minutit, aga anname natukene lisaaega ka ja ütleme et 2,5 minutit. Kui esialgses reaktsioonis on 4 molekuli matriits DNA’d, siis mitu molekuli PCRi produkti on tekkinud pärast 25.tsükli lõppemist. Tehniliselt võiks mõelda et kui on 4 molekuli, siis see on 2 2. Ja tehtud on 2 ringi PCRi. Liidame selle 25le juurde ja saame tehniliselt 27 ringi, kui oleksime alustanud 1 molekuliga. 227=134217728 Praktiline töö nr. 2: Agaroosgeeli valamine Eesmärk: PCR produkti analüüsimiseks vajaliku agaroosgeeli valmistamine. Materjalid: 4,5g Agaroosi pulber Varieerides geeli agaroosisisaldust saame lahutada ka suhteliselt sarnaste pikkustega DNA fragmente. 300ml 1x TAE puhver lahusti 3µl EtBr DNA visualiseerimise reagent (lõppkontsentratsioon
HotFIRE Pol sünteesib keskmiselt 1 kb DNAd 1 minuti jooksul ning selline aeg valitakse nii, et kõik järjestused jõudsid paljuneda ( näiteks meil oli kõige pikem produkt – 2400 aluspaari). 23.DNA lahutamine agaroosgeelis 24. Eesmärgiks on visualiseerida oma produkti ning hinnata selle suurust. DNA lahutamisel kasutatakse agaroosi (disahhariid, koosneb D-galaktoosist ja 3,6-anhüdro-L-galaktoosist). 1. päev: kasutatava agaroosgeeli kangust arvutatakse võttes arvesse oodatava produkti pikkust. Meie kasutasime 1% geeli. Segasime kokku 100 ml TAE puhvrit, 1 gr agaroosi ning kuumutasime mikholaineahjus sulamiseni. Jahtunud geelisegule lisasime1 μl EtBr, mida kasutatakse DNA visualiseerimiseks. Valasime lahus geelialusele ning jätsime tarduma järgmise praktikumini. 2. päev: lisasin PCR segule 4 μl 6x DNA värvi, et DNA nähtav oleks, ning kandsin kogu segu TAE geelile (hambasse)
3 l just puhastatud plasmiidset DNA-d iii. 1 l restriktaasi 10x puhvrit iv. 0,1 l EcoRI restriktaasi (hoida külmas!) 2. Segada, fuugida ja inkubeerida 37oC 30 min 3. Valada 100 ml TAE geeli kontsentratsioon valida oodatavate produktide suuruse järgi 4. Kui 30 minutit on täis, tsentrifuugi uuesti oma kontrollrestriktsiooni, et kokku koguda kaanele kogunenud veetilgad 5. Lisa 2 l 6x DNA värvi ning pipeteeri segu agaroosgeeli hambasse 6. 10-15 minuti järel tee geelist pilt ning analüüsi c. i. Tühja plasmiidi lõikamisel oleks bändide pikkused 17 bp (mida on geelipildil praktiliselt võimatu näha, kui kontsentratsioon pole just väga kõrge) ja 3566 bp. Kui insert on sisenenud, on tekkinud bändide pikkused 360 bp ja 3566 bp. Pildilt on näha kahte bändi kõrgemal, kui 3000 üks on ilmselt õige pikkusega bänd (3566) ja teine
Need gelid on molekulaarseks sõelaks, kus suuremad fragmendid liiguvad aeglasemalt ja väiksemad kiiremini. Agaroosgeele on parem kasutada suuremate DNA fragmentide eraldamiseks, polüakrüülamiidgeele aga väikeste DNA lõikude ja valkude puhul. Polüakrüülamiidgeelis on nukleiinhappel laengu esinemise tõttu väikseimaks erustuvaks üksuseks üks nukleotiid, polüpeptiidahelal aga umbes 10 aminohapet. Agaroosgeeli värvimisel etiidiumbromiidiga läheb see interkaleeruv värvaine DNA kaksikheeliksi nukleotiidide vahele ning DNA fragmente UV valgusega valgustades on need geelis nähtavad roosade helendavate triipudena. 50. Nukleiinhapete hübridiseerimine. In situ koloonia- ja faagilaikude hübriidimine on teiseks käsitlusviisiks rekombinantse DNA selektsioonil. Kolooniahübridiseerimise meetodit kasutatakse peale plasmiidide ka kosmiididega konstrueeritud klonoteekide puhul. Faagilaikude
lahutamiseks. Polüakrüülamiidgeel elektroforees võib olla: • Vertikaalne ühedimensiooniline • Vertikaalne kahedimensiooniline • Horisontaalne Agaroos on lineaarne polümeer, mis koosneb D- ja L-galaktoosi jääkidest. Agaroosi ahelad moodustavad heeliksikujulised fiibrid, mis omakorda agregeeruvad 20-30 nm struktuurideks. Agaroosi geelistumisel moodustub 3-dimensiooniline kanalite (pooride) võrgustik, millede diameeter ulatub 50-200 nm. Agaroosgeeli on võimalik teha erineva suuruse ja poorsusega sõltuvalt DNA fragmentide suurusest, mida kavatsetakse lahutada. Agaroosforees on tehniliselt lihtsam ja kiiremini läbiviidav, aga agaroosi lahutuvus on väiksem kui polüakrüülamiidil. Seega kui foreesil peab eristama väikeste suuruste vahega fragmente kasutatakse polüakrüülamiidforeesi. Agaroos-geelelektroforees võib olla kas • horisontaalne või • vertikaalne
annaabi.ee 
