12. Membraanipotentsiaal, selle tekke põhimõte. Membraanipotensiaal on elektrilise potensiaali erinevus plasmamembraani sise- ja väliskihi vahel, mille tagab transporterite töö. Membraanipotensiaali tekitavavd K + kanalid, kuna nad on tavaolekus avatud. (pinge: 30-120mV). Tekib ioonide erinevast kontsentratsioonist teineteisel pool rakumembraani. 13. Freeze-fracture mikroskoopia, FRAP (Fluorescence recovery after photobleaching), Patch clamp, transfektsiooni viisid. Freeze-fracture mikroskoopia värske koe- või rakuproov sügavkülmutatakse, seejärel murtakse (kasutades näiteks mikrotoomi) (seda vedela lämmastiku temperatuuril). Külmast murdepinnast tehakse siis metallvorm (kuld või plaatium), mida siis hiljem uuritakse (vms). FRAP tehnikat kasutatakse uurimaks membraani difusiooni ja valgusiduvust. Patch clamp tehnika lubab uurida ioonkanalite tööd. Transfektsioon on protsess, mille käigus viiakse võõr-DNA eukarüootsesse rakku
13. 2-4h möödudes pesta rakke 1xPBS-ga ja lisada rakkudele värske sööde (nüüd võib sisaldada ka antibiootikume). Tavaliselt rakkude transfekteerimisel nad külvatakse, lastakse paraja tiheduseni (30-70%) kasvada ja transfektsioonisegud lisatakse kinnitunud rakkudele. Meie kasutame vastupidist tehnikat aja kokkuhoiu huvides. c. Rakud elasid tranfektsiooni üle edukalt mikroskoobi all oli näha, et rakkude tihedus oli kasvanud uuesti 100%-ni. d. Transfektsiooni efektiivsus oli umbes 30%. 13. a. Rakkude fikseerimise ja antikehadega märgistamise protokoll: Vajalike lahuste valmistamine: 1. Fikseerimislahus: 4% PFA 1x PBSis, 10ml. a. 0,4g PFA puru kaaluda väiksesse keeduklaasi b. lisada 1ml 10x PBSi ja 9ml vett c. soojendada magnetsegajal tõmbe all kuni puru on lahustunud. 2. 1xPBS, 50ml. a. 5ml 10x PBS-i. b. Lisada sellele vett (MQ) 50 ml-ni, segada. 3. PBS-Tween: 1xPBS, millele on lisatud 0,05% Tween 20, 50ml a
4. Raputada plaadid segamiseks. Reaktsiooni tulemusena muutub lahuse värvus lillaks (mida rohkem valku, seda tumedam lilla). 5. Aurumise vältimiseks kaetakse plaat kaane või teibiga, inkubeeritakse 30 min 37°C juures, mõõdetakse neeldumist 562 nm juures ning saadud väärtuste järgi arvutatakse valgulüsaadi kontsentratsioon. 116. 117. Transfektsioon 118. Eesmärgiks on tutvustada transfektsiooni meetodit uuritava valgu ekspresseerimiseks loomarakus. 119. Transfektsioon on võõr-DNA (plasmiidid) või RNA (siRNAd) viimine loomarakku. Plasmiidi sisseviimiseks peavad rakud ennast hästi tundma ja paraja tihedusega olema (reeglina 50-70%). 120. Transfekteerimiseks kasutatakse erinevaid võimalusi: keemilised meetodid (nt. kaltsiumfosfaat, katioonsed polümeerid, dendrimeerid, liposoomid ja
so as to carry out the screening of the DNA molecules and analyse the modifications of the transcriptome brought by the transfection. In the drops, the cell can adhere to the support or maintained in suspension kasutatakse rakkude "high-throughtput" testidena uurimaks geenifunktsioone pärast mõjutamist. Positsioonilised kiibid on tehnika kus kasutatakse võrdluseks kindlaid cDNA klastreid X,Y koordinaadistikus. cDNA kloneeritud vektoritesse ja seotud mikroskoobi slaidile, pärast transfektsiooni adhereeruvad rakud moodustavad korrapärase array, eeliseks natiivne vorm. 11. Valgukiibid Valgukiipide eelis - vaheetappide puudumine, otseste interaktsioonide määramine, valguekspressiooni muutuste tuvastamine. Võimaldab tuhandete parameetrite üheagset analüüsi ühes eksperimendis. Valgukiibile on immobiliseeritud valgud, mida kasutatakse eelkõige valk- valk interaktsioonide tuvastamiseks. Rakendustest: antikehade kiibid diagnostikas, uued
annaabi.ee 
