antikeha fluorokroomiga konjugeerida, lisaks võimendab see signaali, kuna iga primaarse antikehaga saab seostuda mitu sekundaarset antikeha. Alusklaasidele panemine on vajalik mikroskopeerimiseks. Sulundamislahus sisaldab DAPI-t, mis seondub DNA-ga ning fluorestseerub siniselt, see võimaldab fluorestsentsmikroskoobiga näha ka DNA-d. 14. a. Kontroll-plasmiidiga rakud: Pildil on näha siniselt DNA, roheliselt edukalt transfekteeritud rakkudes ekspresseeritud GFP ning punaselt antikehaga värvitud tubuliin. pEGFP FoxO3a-ga transfekteeritud rakud: b. Valke detekteerisin kahekihilise reaktsioonina. Primaarseks antikehaks oli Mouse anti tubuliin 1:500 ja sekundaarseks antikehaks Goat anti mouse Alexa546 1:2000. c. Sekundaarne antikeha on valitud kasutatud primaarse antikeha järgi. Kuna primaarne antikeha oli tehtud hiires, kasutasime kitses toodetud antikehasid, mis tunnevad ära hiire
sisseviidud DNA-valk kompleks seostuda just spetsiifilisse kohta rakus, ning tänu fluoroessents-efektile on näha see spetsiifiline koht ka valgusmikroskoobis nähtav.Ekspressioonikonstruktid olid plasmiidid GFP järjestuse ja erinevate signaalidega, mille tõttu ekspresseerus GFP erinevates rakupiirkondades. PEI polüetüleenimiin pakib DNA kokku ja interakteerub membraaniga ja difundeerub läbi membraani. · Kas transfekteeritud DNA integreerub genoomi v on rakus episomaalselt? Võõras DNA ei lähe genoomi koosseisu, sest on tsirkulaarne. Enne tuleks lineariseerida. Lisaks GFP-le peavad olema antibiootikumide resistentsusgeenid- nii saab rakke ära tunda. · Kas saab transfekteerida ka lineaarset DNA molekuli? Saab, aga see on juhuslik ja väikese efektiivsusega. · Lisaks GFP-le teised liitvalgu tag'id His-tag- 6-8 his jääki Flag-tag GST-tag Kordamisküsimused 2.prax:
Organiseeritud kudede parafiinlõigud (0,6mm).Koostatud sadadest prooviblokkidest . Kasutatavad metoodikad: 1.IHC 2.ISH 3.FISH 4.HC Koekiipide plussid ja miinused: -Uute antikehade sobivuse testimine -Uute prognostiliste antigeenide leidmine -Arengubioloogilised küsimused -Võimalus kiirpatoloogiliseks uuringuks -Võimalik edasiarendus rakukiip -Kudede omadused muutuvad sügavuti -Paljud antikehad ei tööta parafiinlõikudel -ICH on raskesti kvantifitseeritav -Suhteliselt kallid 10.Rakukiibid Transfekteeritud rakkude mikrokiibid: Positsionaalsed ja mittepositsionaalsed kiibid 25 Kasutatakse imetaja rakkudes ,,high-throughput" testidena uurimaks geenifunktsioone pärast mõjutamist potensiaalsete ravimite, patogeenide, keskkonnamõjude, stressifaktorite jne. poolt Positsionaalsed kiibid on tehnika, kus kasutatakse võrdluseks kindlaid cDNA-si ekspresseerivaid rakuklastreid X,Y koordinaatides. cDNA-d, on kloneeritud
plasmiidi või teist töödeldi S1 nukleaasi kaitse meetodiga (3). Restriktsiooni lõigu proov, mis oli saadud -globiini cDNA kloonist, oli komplementaarne 5' otsale -globiini mRNA-s. 5'ots proovis märgistati 32P (punane täpp). -globiini mRNA kaitstud proovi hübridiseeriti ~340-nukleotiidine lõik, mida oli lagundatud S1 nukleaasiga, mis lagundab üksikahelalise DNA, aga mitte RNA-DNA hübriidi. Autoradiograafia elektroforeesitud S1-kaitstud lõikudest (4) näitas, et rakud, mida oli transfekteeritud plasmiid 1-ga (1. rida) tootsid palju rohkem -globiini mRNA-d kui need, mida oli transfekteeritud plasmiid 2-ga. Tulemused näitaad, et SV40 DNA fragment plasmiidis 1 koosneb elemendist, enhancerist, mis stimuleerib -globiini mRNA sünteesi. 40. Nimeta vähemalt 3 üldist bioloogilist protsessi, kus enhancerite aktiivsusega kontrollitakse geeni ekspressiooni tasemeid? Rasvlahustuvad steroidhormoonid (östrogeen, testosteroon) võivad difundeeruda läbi plasmamembraani ja
annaabi.ee 
