miRNAdel on osaline komplementaarsus märklaud-RNAga 3’mittetransleerivas osas. Dicer lõikab pre-miRNA lühikesteks RNAdeks. Lõikamise järgselt tekib dupleks, millest üks ahel on valmis miRNA ja teine temaga osaliselt komplementaarne vastasahel. Tagajärjeks on translatsiooniline repressioon või märklaud mRNA degradatsioon ja geeni vaigistamine. siRNA – Pakitakse samuti RISC kompleksi. siRNAd paarduvad sihtmärgiga täieliku komplementaarsuse alusel ja indutseerivad RNAi – märklaudgeeni lõikamist ja degradatsiooni. On väga levinud taimedes kus kaitsevad taime erinevate patogeenide eest. Tekivad pikkadest kaheahelalistest RNA lõikudest. piRNA – suuremad kui miRNAd ja siRNAd. Seonduvad PIWI perekonna valkudega, millede välja lülitamisel väljendub kordusjärjestuste kontrollimatu transkriptsioon
dupleksid. Need väikesed RNAd järgnevalt seonduvad valguperekonnaga Argonaute. Tulemuseks on geeni vaigistamine. siRNA ja miRNA loomisel Dicer või Dicerisarnased (DCL) valgud lõikavad pikad dsRNA (kaksikahelaline RNA) või tagasivolditud (linguvõi juuksenõela-kujuline) RNA väikesteks ~ 21 25 nt fragmentideks siRNA-d kaitsevad genoomi: · Löövad tagasi sissetungivad viirused · Vaigistavad ,,hälvik-transkripte · Vaigistavad transposoone ja korduselemente siRNAd samuti hoiavad mõnede geenide epigeneetiliselt vaigistatud staatust. Enamus taimeviiruseid on RNA viirused, mis paljunevad läbi kaksikahelalise vaheetapi. Kaksikahelaline RNA (dsRNA) lõigatakse Diceri (DCL) valgu poolt, et tekitada siRNA molekule, mis seonduvad AGO valguga, et vaigistada viiruse replikatsiooni ja ekspressiooni. Viiruse infektsioon tekitab süsteemset siRNA kogunemist Viirustel on valgud, mis suruvad alla RNA vaigistamise.
52. Loetle kõik tuumakeses sünteesitavad RNA tüübid. Missugused ensüümid neid RNAsid transkribeerivad? Jälle üks ulme küsimus. Eeldan, et tuumakeses on DNA ja DNAlt transkribeeritakse RNA, siis enamik teadmist vajavad RNAd saavad transkribeeritud tuumakeses. rRNA'd sünteesib RNAPolI; mRNAd, enamiku snRNAd ja miRNAd sünteesib RNAPolII; tRNAd ja teisi väikesi RNAsi sünteesib RNAPolIII. RNAPolIV sünteesib siRNAd taimedes. 53. Mis vahe on miRNAl ja siRNAl? Märklaud-mRNAga paardumisel ei ole miRNA 3' otsa paardumine korrektselt komplementaarne on üksikuid mittepaardunuid nukleotiide. siRNA'l on paardumine alati täpne. See vahe ongi. 54. Kirjelda hnRNP A1 tuumast ekspordi protsessi. Missugused valgud selles osalevad? Kuidas rakk kontrollib, et see protsess on ühesuunaline? Missugune tsütoplasmaatiline valk on selle protsessi toimumiseks oluline ja miks?
5. Aurumise vältimiseks kaetakse plaat kaane või teibiga, inkubeeritakse 30 min 37°C juures, mõõdetakse neeldumist 562 nm juures ning saadud väärtuste järgi arvutatakse valgulüsaadi kontsentratsioon. 116. 117. Transfektsioon 118. Eesmärgiks on tutvustada transfektsiooni meetodit uuritava valgu ekspresseerimiseks loomarakus. 119. Transfektsioon on võõr-DNA (plasmiidid) või RNA (siRNAd) viimine loomarakku. Plasmiidi sisseviimiseks peavad rakud ennast hästi tundma ja paraja tihedusega olema (reeglina 50-70%). 120. Transfekteerimiseks kasutatakse erinevaid võimalusi: keemilised meetodid (nt. kaltsiumfosfaat, katioonsed polümeerid, dendrimeerid, liposoomid ja katioonsed lipiidid) ja füüsikalised meetodid (nt. elektroporatsioon, sono-poratsioon, optiline transfektsioon, magnetogektsioon, mikroinjektsioon). 121
valgulüsaadi kontsentratsioon. Keskmine valgukontsentratsioon on 0,34 μg/μl. Valgu sisaldus tehakse kindlaks kalibreerimiskõvera järgi. Kalibreerimiskõver ise ehitatakse standaarse valgu järgi (lahjendusterea järgi), kus x teljel on kontsentratsioonid ja y teljel on mõõdetud optilise tihedus. Figure 2 illusteeriv pilt 4. Praktikum - transfektsioon Transfektsioon on võõr-DNA (plasmiidid) või RNA (siRNAd) viimine loomarakku. Transfekteerimiseks kasutatakse erinevaid võimalusi: keemilised meetodid (nt. kaltsiumfosfaat, katioonsed polümeerid, dendrimeerid, liposoomid ja katioonsed lipiidid) ja füüsikalised meetodid (nt. elektroporatsioon, sono-poratsioon, optiline transfektsioon, magnetogektsioon, mikroinjektsioon). Meie majas on kasutusel ka Amaxa Nucleofector –aparaat, mis kombineerib elektroporatsiooni ja keemilisi transfekteerimise meetodeid
annaabi.ee 
