90. Enamus rakuliine vajab kasvamiseks temparatuuri 37 °C ja pH-d vahemikus 7,2 – 7,4. Selliste tingimuste tagamiseks kasutatakse spetsiaalseid inkubaatorkappe, kus lisaks vajalikule temp. on ka kõrgem CO2 sisaldus (5%), mis võimaldab stabiilse pH säilitamise. 91. 92. Teine päev – rakkude paljundamine 93. Esmalt tuleb rakkud vaadelda mikroskoobis, et hinnata nende tihedust ning seisukorda. Rakud ei ole saastanud ega surnud ning nende tihedus on umbes 20%. 1. Pesta rakke 1x PBSiga (PBS on sobiva pH-ga ja osmootset tasakaalu hoidev lahus). Selleks rakkudelt imeda vaakumiga sööde (tassi kallutades), pipeteerida 4 ml PBSi tassi külje vastu, et rakud lahti ei tuleks, loksutada õrnalt ning rakkudelt imeda vaakumiga PBS. PBSiga pestakse rakke selleks, et eemaldada surnud rakud, söötmejäägid ja seerum. 2. Lisada 0,2 ml trüpsiin-EDTA lahust, inkubeerida mitte rohkem kui 5 min. Trüpsiin on
mittekleepunud ujuvad rakud on, kuid enamus on kinnitunud), kleepinud tassile ja paiknevad ühtlaselt, kuid nende tihedus on umbes 20%. NIH3T3 rakud on fibroplastid, seega nende kuju on omapärane, näha mitut adhesiooni kohta. Figure 1NIH3T3 mouse fibroblasts, Wikipedia Rakkude tassilt lahti võtmine ja paljundamine (NB! Aseptika!): Pestsin rakke tassi kallutades 4 ml 1x PBSiga (Phosphate-buffered saline), selleks et vabaneda surnutest rakkudest ja seerumi- ja söötmijaakidest ja valmistada rakud trüpsiiniga töötlemiseks Imesin vaakumiga PBS Lisasin 0,2 ml trüpsiin-EDTA 5 min-ks. Trüpsiin on proteaas, mis lõikab katki rakuadhesiooni valgud selleks, et rakud plastiku küljest lahti saada. Lisalin 1 ml söödet (DMEM + 10% FBS + PEST) selleks, et inhibeerida proteaasi.
4. Tõsta katteklaasid steriilsete pintsettide abil 24-augulise plaadi kahte auku. 5. Pipeteerida transfektsioonisegud klaasidele. Aja kokkuhoiu mõttes jätsime meie ära tsentrifuugimise ning pipeteerisime transfektsioonisegu kohe klaasile ning alles seejärel inkubeerisime 15 minutit. Rakkude külvamine 24-augulisele plaadile 6. Rakkude vaatlemine mikroskoobis. Rakkude tihedus umbes 100% 7. Rakkudelt imeda vaakumiga sööde, pesta 1 ml PBSiga , PBS ära imeda. 8. Lisada trüpsiin-EDTA lahust 0,2 ml, inkubeerida mitte rohkem kui 5min. 9. Lisada 1ml söödet (DMEM + 10% FBS NB! antibiootikumideta), suspendeeri rakud 1ml automaatpipetiga tassi küljest lahti. 10. Teha söötmega sobiv lahjendus, et rakkude lõpptihedus 24-augulisel plaadil oleks 33,3%. Arvestada 0,5 ml rakususpensiooni augu kohta. Selleks võtta 40 µl rakususpensiooni ja 410 µl söödet augu kohta. 11
rohkem rakke. Ülemised helendavad rohkem. Immuunofluorestsents. Aktiinifiibrite ja tuuma visualiseerimine miks vaja? 1) valkude paiknemise uurimine raku sees, pinnal ja kudedes. 2) valkude ekspressioonitaseme hindamine (eri rakuliinides ekspresseeruvad valgud erinevas hulgas. 3) erinevate valkude omavaheline paiknemine ja interaktsioonid rakus. Rakkude fikseerimine PBSiga (paraformaldehüüd) rakus olevad valgud ristseotakse lüsiini kaudu rakk tardub. Triton-X lahusega jääl teeb rakumembraani auklikuks (triton-X seob endaga membraani lipiide). Tulemus: antikehad ja muud elusasse rakku sisenemisvõimetud ühendid pääsevad rakku (falloidoon ja DAPI). Blokeerimine enne antikehatöötlust eesmärk on vähendada rakkudes piirkondi, kuhu antikeha võiks mittespetsiifiliselt seonduda (Passiivne adsorptsioon). Blokeerimine toimub
annaabi.ee 
