Visasin läbivoolatud puhver kolonnist ära. 4. Pipeteerisin peale 200 μl pesupuhvrit. Fuugimine – 30 sek, visasin läbivoolatud puhver kolonnist ära (seda etapi tuleb korrata 2 korda) 5. Järgmisena pipeteerisin kolonni keskele 10 μl MQ vett (elueerimiseks). Vett saab kasuta ainult juhul, kui selle pH > 6,0. 6. Jälle fuugimine 1 minuti jooksul – praimerite, nukleotiidide ja erinevate soolade eraldamine. Epsis on elueerinud PCRi produkt, mis on valmis edasiseks ligeerimiseks. 37. 38. 39. 40. Kontrollgeeli pilt. Oodatav produkti pikkus – 700 aluspaari, pildil on näha, et umbes nii see ongi. 41. 42.Rekombinantse plasmiidi ligeerimine 43. Eesmärgiks on meie DNA järjestuse sisestamine vahevektorisse ehk tervikliku plasmiidi taasloomine. Väga tähtis segada vektor ja sisestav DNA omavahel sobivates kontsentratsioonides, iga molekuli vektori jaoks peaks olema segus kolm sisestava DNA molekuli
Viirus-partikkel liikub rakkust välja ilma selle raku lüüsita 15. DNA fragmenti on võimalik ligeerida ,,blunt-end" või ,,sticky-end" ligeerimise abil. Millised on poolt ja vastu argumendid mõlema meetodi puhul. Millised probleemid võivad esineda? Blunt-end + pole vaja komplimentaarset fragmenti ligeerimiseks, kuna blunt otsad võivad teiste mistahes blunt otstega ligeerida. Vektor ise kokku ei kleepu. -vähem efektiivne meetod ja aeglasem, kuna niisuguste otste kokku puude on juhuslik. Sticky end + lihtsam ligeerida, otsad on komplimentaarsed ja kergesti leiavad teine teist ning ligeeruvad kokku -selle meetodi puhul, pärast restriktaasidega töötlemist, vektor võib kiiresti tagasi kokku ligeerida (lahenduseks defosforüülimine, aga see võib takistada ligeerimist).
vektor enam ei kodeeri ensüümi, mis lõhub β- galaktosidaasi, kuna inserdi sisestamisel me rikkume selle geeni lugemisraamid. Selle alusel põhineb meie sini-valge selektsioon: bakterid lõhuvad galaktosidaasi – ei sisalda inserdi, ei lõhu – sidaldavad. Selle protsessi saab ka visualiseerida. Ligeerimiseks segasime kokku: 1,5 µl MQ vett 1 µl puhastatud PCR produkti – L-Desmo 1 µl plasmiidi, ehk pSTBlue-1 vektorit 1 µl T4 DNA ligaasi, mis on kauem aktiivne ja teeb ligeerismist täpsemalt 4 kraadi juures. 0,5 µl 10xligeerimis puhvrit Kuna töötasime väga väikese mahuga, siis segasin kõik reagendid pidevalt suspendeerides ja segasin segu otsikuga
keemia). Kirurgia arengule annavad tõuke kolm tegurit: 1) Kunstlik veretustamine/vereülekanne Ambroise Pare (1510-1590) haavaravi isa , kelles olid ühendatud habemeajaja ja õppinud arsti oskused. Võtab taaskasutusele kreeklaste, Galenose ja araablaste meetodid haavade raviks ja veresoonte ligeerimiseks amputatsioonidel. Verejooksu kontrolli alla saamist peetakse Paré teeneks. James Blundell teeb esimese vereülekande inimeselt inimesele 1818. aastal. Sama mees valmistas ka aparaadi (nn impellor) sääraste protsesside läbiviimiseks. Riist olevat kasutusel olnud kuni 20. sajandi alguseni. 1900
annaabi.ee 
