Anna Pertel 134823YASB ENSÜMOLOOGIA PRAKTIKUM ALUSELISE FOSFATAASI ENSÜÜMIKINEETIKA 1. Ensüümi kontsentratsiooni (E) mõju reaktsiooni kiirusele (v) Varieerub fosfataasi kontsentratsioon, teised parameetrid on konstantsed. Töö käik: Eppendorf tuubi segasin puhverlahuse(pH=9,5), MilliQ vee ja pNPP. Inkubeerisin 2 minutit ning seejärel lisasin ensüümi (120 000x lahjendus) ning inkubeerisin 15 minutit. Reaktsiooni lõpetasin 0,1 M NaOH lisamisega. Seejärel määrasime optilise tiheduse 410 nm juures. Andmed: A=0,059 Ao=1 Co=1mg/ml Küveti laius: l=0,5 cm Ekstinktsioonikoefitsent: ε410 nm=18400 M-1cm-1 Reaktsiooniaeg: t=15 min Arvutused: Produkti kontsentratsiooni arvutan optilise tiheduse järgi (Lambert-Beeri A
Oodatav pikkus – 700 aluspaari. 32. 33.PCR produkti puhastamine geelist Zymoclean kitiga. 34. Eesmärgiks on puhastada välja PCRi segust meid huvitav produkt, et vältida praimerite, nukleotiidide või erinevate soolade mõju järgmisele etapile. 35. Plasmiid mEB1 pEGFP-N1, praimerid mEB1F ja mEB1R. Oodatav pikkus – 700 aluspaari. 36. Puhastamine: 1. Saadud geelitükk kaalus 0,04 g. Lisasin 120 μl ADB-d (0,3 ml 0,1 g geeli kohta) 2. Inkubeerisin 37 °C juures 5 minutit, et geelitükk oleks täielikult sulanud 3. Pipeteerisin segu kolonni, mis on omakorda kogumistopsis. Tsentrifuugimine – 30 sek, et kogu lahus jookseks läbi kolonni. Visasin läbivoolatud puhver kolonnist ära. 4. Pipeteerisin peale 200 μl pesupuhvrit. Fuugimine – 30 sek, visasin läbivoolatud puhver kolonnist ära (seda etapi tuleb korrata 2 korda) 5. Järgmisena pipeteerisin kolonni keskele 10 μl MQ vett (elueerimiseks). Vett saab kasuta ainult
Inaktiveerisin ligaasi, 10 min 5 juures. jooksul 70 C Võtsin -80 C 5 juurest 10 min jääle sulama komptentsed rakud Võtsin 20 µl rakke ja lisasin ligatsioonisegule ja inkubeerisin 30 min jääl Teostasin Heat shocki: inkubeerisin 90 sek väitel 42 C 5 juures transfoneeritud segu, kohe tõstsin 2 minutiks jääle (membraaniaugu sulegemiseks) Lisasin segule 500 µl vedelsöödet ja panin inkubeerima 30 min-ks inkubeerima 37 C 5 juures (et rakud jaguksid) Tsentrifugeerisime bakterid põhja 3000 rpm 2 min ja rakupeal olev sööde valasin kraanikaussi
toitaineid, ning PEST-i. FBS on vajalik, kuna kunstlikult valmistatud söötmes ei pruugi olla sobiv kogus vajalikke toitaineid, lisaks on odavam lisada söötmele seerumit, kui kõiki vajalikke toitaineid eraldi. PEST on antibiootikum, mis on vajalik saastumisohu vähendamiseks. 10. a. Enne trüpsineerimist eemaldasin rakkudelt söötme ning pesin rakke PBS-iga. Seejärel lisasin rakkudele trüpsiin-EDTA lahust ning inkubeerisin 3 minutit. Lisasin söödet ning suspendeerisin rakud plaadilt lahti. i. PBS-iga pesemine on vajalik , et eemaldada söötmejäägid, surnud rakud ja seerum, mis takistavad trüpsiini toimimist. ii. Liiga kaua inkubeerides hakkab trüpsiin lagundama ka rakku ennast, mitte ainult rakku plaadile siduvaid valke. b. Rakkude tihedus plaadil oli umbes 50%, kuna plaadi suurus jäi samaks, tuli 10% tiheduse saavutamiseks plaadile alles jätta 1/5 rakususpensioonist
annaabi.ee 
