(3) Ligeerimisreaktsiooniks pipeteeri järgmisi komponente sellises järjekorras (teostab iga üliõpilane): 3 l restrikteeritud genoomset DNA-d + 1 l Cfr42I restrikteeritud pBS SK+ plasmiidi (10 ng) (teostatud juhendaja poolt) + 1 l 5 x ligeerimispuhvrit kokku 6 l + 1 l (5 ühikut) T4 DNA ligaasi (jääl) Selleks, et toimuks konkatemeersete DNA struktuuride moodustumine, peab [DNA] > 5 ng/l. (4) Inkubeeri toatemperatuuril kuni 24 h. Reaktsiooni võib alustada ka madalamal temperatuuril (näiteks 15 oC). Inkubeerimisaegadel lahendada allpool toodud lisaülesanne, vt lisamaterjale ja kuula juhendaja näpunäiteid. 2 Lisaülesanded (teoreetilised): 1.1) Vaata Fermentase kataloogist, milline on Cfr42I jaoks kõige sobivam puhver (viie puhvri süsteemis)
Ligeerimine kahe nukleiinhape molekuli kokku kleepumine, kasutades fermenti DNA-ligaas. 3 l restrikteeritud genoomset DNA-d + 1 l Cfr42I restrikteeritud pBS SK+ plasmiidi (10 ng) (teostatud juhendaja poolt) + 1 l 5 x ligeerimispuhvrit kokku 6 l + 1 l (5 ühikut) T4 DNA ligaasi (jääl) Selleks, et toimuks konkatemeersete DNA struktuuride moodustumine, peab [DNA] > 5 ng/l. (4) Inkubeeri toatemperatuuril kuni 24 h. Reaktsiooni võib alustada ka madalamal temperatuuril (näiteks 15 oC). Inkubeerimisaegadel lahendada allpool toodud lisaülesanne, vt lisamaterjale ja kuula juhendaja näpunäiteid. 2 Lisaülesanded (teoreetilised): 1.1) Vaata Fermentase kataloogist, milline on Cfr42I jaoks kõige sobivam puhver (viie puhvri süsteemis). Millistes puhvrites see ensüüm veel töötab? Lisaks tutvu kataloogis olevate tingmärkidega
c) Transformeerimise protokoll: 1. Inaktiveeri ligaas inkubeerides eppendorfi 10 min 65 °C vajalik, et lõpetada vektori ja inserdi ligeerimine ja hoida ära soovimatud ligeerimisprotsessid segus. 2. Transformeerimiseks võta -80°C juurest 10 minutiks jääle sulama kompetentsed rakud. jääs hoidmine on vajalik, kuna külmutatud rakud on väga tundlikud kõrge temperatuuri suhtes. 3. Transformeermiseks võta 20 l kompetentseid rakke ning lisa ligatsioonisegule. 4. Inkubeeri 30 min jääl. vajalik efektiivsuse suurendamiseks keemiliselt kompetentseks muudetud rakkude puhul, kuna külmades tingimustes kinnitub DNA rakuseinale. Etapi võib jätta vahele, või lühendada, kuid see vähendab transformatsiooni efektiivsust. 5. Selle aja jooksul vala LB+Amp+X-gal+IPTG tassid 6. Heat shock: inkubeeri transfornatsioonisegu 90 sekundit 42 oC juures. järsk temperatuuritõus tekitab plasmamembraani poorid ning võimaldab DNA-l rakkudesse siseneda.
1. Iseloomusta loovus profiili Loovus ideede, info ja elementide kombineerimine / ühendamine eelnevast erineval moel, mille tulemusena luuakse midagi uut, pakutakse uus võimalus, idee. 4 loovusprofiili: Kujutle, Inkubeeri, Investeeri, Paranda · Ideed ehk kujutlused radikaalselt uudsed tooted, teenused ja turud Walt Disney · Investeeringud lühiajaliste eesmärkide saavutamiseks tugev töö, head partnerid, fokusseeritud initsiatiiv - IBM · Inkubatsioon ehk pikaajaline väljaarendamine ühtsustunde arendamine jagatud väärtuste ja üksteiselt õppimise kaudu AA · Ilmutamine ja parandamine süsteemid, standardid, struktuurid ja protseduurid McDonalds 2
lahenduse projekteerimine, võimalike probleemide analüüs, juurutusprogrammi koostamine, katsetamine; · Üleminek uuele, muutmine (cooperation)- vahetu uuele üleminek, motivatsioon tegutsemiseks, innovaatiline õppimine; · ,,Kinnikülmutamine" (freesing)- ehk stabiliseerimine, püsiva iseregulatsiooni saavutamine, kontrollimine ja korrigeerimine. 4. Ettevõtete loovusprofiilid 4 loovusprofiili: Kujutle, Inkubeeri, Investeeri, Paranda Ideed ehk kujutlused radikaalselt uudsed tooted, teenused ja turud Walt Disney Investeeringud lühiajaliste eesmärkide saavutamiseks tugev töö, head partnerid, fokusseeritud initsiatiiv - IBM Inkubatsioon ehk pikaajaline väljaarendamine ühtsustunde arendamine jagatud väärtuste ja üksteiselt õppimise kaudu AA Ilmutamine ja parandamine süsteemid, standardid, struktuurid ja protseduurid McDonalds 5
annaabi.ee 
