Lambert-Beeri seaduse kohaselt on valguse absorbtsioon mingi aine lahuses võrdeline lahustunud aine molaarse kontsentratsiooniga. Läbilaskvuse - T kaudu väljendatuna näeb Lambert-Beeri seadus välja nõnda: I = I 0 ×10 - cd Bradfordi meetod valgu kontsentratsiooni määramiseks Bradfordi meetod on väga populaarne valgu kontsentratsiooni määramise meetod, kuna see on lihtne, kiire, odav ning tundlik. Meetod baseerub orgaanilise värvaine - Coomassie brilliant blue G-250 (CBBG) (Joonis 1) ja valgu vahelise kompleksi kolorimeetrilisel detekteerimisel. Joonis 1. Coomassie brilliant blue G-250 struktuur Molekulaarsel tasemel põhineb Bradfordi meetod Coomassie Blue G-250 erinevalt protoneeritud vormide vahelisel tasakaalul ja selle nihutamisel CBBG valgukompleksi poolt. Kahekordselt protoneeritud CBBG kogulaeng on +1, see vorm esineb tugevalt happelises keskkonnas ja on punase värvusega (max470 nm). Ühekordselt protoneeritud CBBG
Iga bänd vastab ühele või mitmele polüpeptiidi tüübile, mis omavad sarnast molekulmassi. Mida raskem makromolekul seda rohkem on tema liikumine takistatud. Kui proov tungib läbi lahutava geeli toimub eraldumine nn. bändideks, kusjuures raskemad polüpeptiidid jäävad ülemissse ning kergemad geeli alumisse osasse. Iga bänd sisaldab ühte või mitut polüpeptiidi sama või erineva molekulmassiga. Valkude detekteerimiseks polüakrüülamiidi geelist kasutatakse tavaliselt 0,1 % Coomassie Blue nimelist värvi 50 % metanoolis ja 10 % äädikhappe Lahuses. Happeliseks muudetud metanool sadestab valke. Värvimist teostatakse tavaliselt üleöö. Värv tungib läbi kogu geelist, kuid värvuvad siiski ainult valgud. Figure 1 Foreesiaparaat Praktiline osa. Geelikihtide valmistamine: 1. Valmistasime lahutava geeli (resolving gel) (10%). Selleks segasime omavahel antud järjekorras kokku: mQ – 4,0 ml 4x lahutava geeli puhver (1,5M Tris-Cl, pH 8,8) – 2,5 ml
jõudnud (tavaliselt ~1 tund 180 V juures). Elektroforeesi kulgu tuleb jälgida ning tuleb veenduda, et geel üle ei kuumeneks (alanda pinget 150V-ni). 4. Lülitasime foreesiaparaat elektrivõrgust välja, kogu puhvrivannidest puhver kokku ja valasime tagasi puhvri pudelisse, võtsime geeli aparaadist välja, eraldasime klaasplaadid teineteisest väga ettevaatlikult kasutades väikest spaatlit. 5. Panime geeli ööseks Coomassie G250 värvilahusesse. 6. Saime elektroforeesi tulemust : Lahtrites vasakust paremale : 1. Marker 2. BSA (Mw = 66,5 kDA) 3. Trypsin (Mw =23,8 kDA) 4. Lactate dehüdrogenase ( Mw = 35 kDA) 5. Tundmatu 6. Albumin (Ovalbumin) (Mw = 44,3 kDa) 7. Proteinase K ( Mw = 28,5 kDa) Migreerumistee Mw Valk pikkus (cm) (kDA) BSA 2.9 66.5
kasutatakse periodontiidi ravis. Lisaks on kasutusel ka ravimid, mis aktiveerivad ECMi lõhkuvaid proteaase. nt urokinaas ja streptokinaas aktiveerivad seriinseid proteaase (plasmiini) ja on kasutuses ägeda müokardi infarkti, kopsude trombemboolia jt haiguste puhul, kus trombide lõhkumine aitab taastada verevarustust. 126. Kontsentratsioonide arvutused, lahjenduste tegemine. Lahjendus – aine kontsentratsiooni vähendamine lahuses. Põhiline on c1 x v1 = c2 x v2. 127. Bradfordi meetod Coomassie Brilliant Blue (CBB) – värvaine, millest valmistatud lahus on tavaoludes eresinine ning neelab valgust 595 nm peal. Tugevalt happelises keskkonnas seevastu moodustub kolloidlahus, kus selle tavaline värvus kaob, molekuli neeldumismaksimum nihkub 595 nm pealt 465 nm peale ning lahus omandab punakas-pruuni värvuse. Bradfordi meetod valgu tuvastamiseks põhineb asjaolul, et CBB molekulid on võimelised seonduma valgumolekulide külge, mille tulemusena nihkub nende neeldumismaksimum
annaabi.ee 
