DNA järjestust. PRC rakendamiseks on vaja teada amplifitseeritavast DNAst primaarjärjestust paljundatava DNA piirkonna mõlemast otsast.PRC toimub kolmeetapiliselt: 1. Amlifitseeritava DNA denatureerimine emperatuuri toimel (92-95 kraadi juures) 2. DNA renatureerimine temperatuuri langetamisel ülehulgas lisatud sünteetiliste oligonukleotiidsete praimerite juuresolekul, millest üks on komplementaarne amplifitseeritava DNA ühele ahelale, teine selle vastasahelale.Selle toimel hübridiseeruvad praimerid amplifitseeritava DNA ahelatega. 3. DNA replikatsioon ahelate kinnitunud 47.Kromatograafia Keemiliste ühendite füüsikalis-keemiline ükteisest lahutamine, mis põhineb aineosakeste korduval ümberjaotumisel liikuva ja liikumatu faasi vahel. Liikuvas faasis olevas aineosakesed kanduvad selle vooluga kaasa järjekordse siirdumiseni liikumatusse faasi
f. 10 minutit 72 kraadi juures, et pikendada poolikuks jäänud PCRi produktid Millist template DNA-d ja praimereid kasutasin? Mille järgi valitakse PCR praimerite hübridiseerimise ehk annealing temperatuur? Milline sulamistemperatuur on praimeril l 5’- GCCATCTCATGCCCATCGC -3’ standardtingimustel ja millist hübridiseerimistemperatuuri kasutaksin? Kuidas need leidsin? Hübridiseerimise temperatuur ja aeg sõltub kasutavate praimerite sulamistemperatuurist, amplifitseeritava DNA konsentratsioonist ja reaktsioonisegu koostisest. Antud järjestuse sulamistemperatuuriks on 59,3 kraadi, mille leidsin: http://eu.idtdna.com/site/Order/oligoentry/set? seq=GCCATCTCATGCCCATCGC. Kasutaksin hübridiseerimistemperatuuriks 59 kraadi. Mille järgi valitakse ekstensiooniaeg? Kui pikk see oleks 2000bp produkti korral, kasutades samu reagente nagu praktikumis? 4
Nende seondumine DNA-ga on vajalik, kuna alad, kuhu praimerid kinnituvad, on fragmentide sünteesi initsiaatoriteks. Praimerid seonduvad komplementaarsusprintsiibi alusel mõlemale poole piirkonda. 2. Praimerite seondumine DNA ahelatega. Praimerite seondumine ehk annealing toimub 5070 °C juures. Selleks, et kinnitustemperatuur mõistlik oleks, tulebki praimerid teha 20 nukleotiidi pikkused. Sellisel juhul ongi nende sulamistemperatuur vajalikus vahemikus. 3. DNA süntees. Kui praimerid on amplifitseeritava DNA järjestuse kahelt poolt kindlaks teinud ja piiranud, sünteesib termostabiilne DNA polümeraas praimerite 3' otsast alates mõlemale DNA üksikahela fragmendile komplementaarse fragmendi, kasutades selleks segusse lisatud nukleotiide. Protseduur toimub 72 °C juures ning selleks kasutatakse termostabiilset Taq polümeraasi. Neid tsükleid korratakse 2030 korda, et amplifitseerida piisav arv DNA molekule. 45. Kuidas on polümeraasi ahelreaktsioon muutnud geenitehnoloogiat? PCR on
PCR-i puhul on vaja teada lühikesi järjestusi kahel pool sünteesitavat piirkonda. Külgnevate järjestuste järgi on sünteesitud komplementaarsed praimerid, tavaliselt 15–25 nukleotiidi pikkused oligonukleotiidid. Nende seondumine DNA-ga on vajalik, kuna alad, kuhu praimerid kinnituvad, on fragmentide sünteesi initsiaatoriteks. Praimerid seonduvad komplementaarsusprintsiibi alusel mõlemale poole piirkonda. Kui praimerid on amplifitseeritava DNA järjestuse kahelt poolt kindlaks teinud ja piiranud, sünteesib termostabiilne DNA polümeraas praimerite 3’ otsast alates mõlemale DNA üksikahela fragmendile komplementaarse fragmendi, kasutades selleks segusse lisatud nukleotiide. Näitab mis järjestus DNA-s on. DNA polümeraas pikendab olemasolevat DNA ahelat, kuid selleks et DNA polümeraas saaks DNA- le kinnituda on vaja RNA molekule (praimerid), mis on komplementaarsed DNA molekuliga
annaabi.ee 
