ränioksiidiga. (seondumisele aitab kaasa, eelnev ADB puhver). Elueerimispuhvri omadustest on kõige olulisemad madal soolasisaldus ja aluseline pH. Millist olulist infot saan kolonnide kohta firma kodulehelt? Kas kasutatud kit sobis antud praktikumi töö teostamiseks, millest seda järeldada? Aeg 15 minutit Vajatav varustus Tsentrifuug DNA suurus 50bp kuni 23kb Sobivad proovid DNA TAE/TBE puhvriga agaroosgeelist DNA puhtus Kõrge kvaliteedi, puhtusega DNA, mis on sobilik sekveneerimiseks, ligatsioonireaktsiooniks jne... Kui palju DNA saadakse 50bp-10kb puhul 70-90% Praktiline töö nr. 5: Rekombinantse plasmiidi ligeerimine
promootorjärjestusest, see on kõige sagedasem, mis esineb tavaliselt kõrge transkriptsioonitasemega geenide promootorites, initsiaator enamikul neist on C positsioonis -1 ja A positsioonis +1, erinevalt TATAst pole konserveerunud, CpG saarekesed. TATAboxi või initsiaatorjärjestust sisaldavate geenide transkriptsioon algab vastavalt elemendilt, CpG saarekeste puhul aga 20-200bp ulatuses mitmelt võimalikult elemendilt. Enamikul neist geenidest on ca 100bp kaugusel start-saidist 20-50bp pikkune GC-jada. Proksimaalne promootor. Regulaatorelemendid, mis asuvad 100-200bp start-saidist, moodustavad koos TATAboxi või initsiaatoriga promootori proksimaalsete elementide kogumi ehk proksimaalse promootori. Distaalne promootor. Kaugemal asuvad elemendid moodustavad koos TATAboxi või initsiaatoriga distaalse promootori. 6. Defineeri enhancer ja loetle enhanceri omadused. Enhancer on promootorist kaugelasuv transkriptsiooni regulaatorala
polümeraasi kompleks moodustub ja regulaatorjärjestustest (cis elemendid ja võimendajad ingl enhancer), millega seostuvad regulaatorvalgud. Cis - elemendid peavad asuma DNA samal ahelal millelt toimub mRNA süntees. (Mutatsioonid promootoris või regulaatorpiirkonnas on cis-toimega, sest nad mõjutavad ainult selle geeni ekspressiooni kus mutatsioon toimus) Regulaatorelemendid, mida nim võimendajateks (ingl enhancer) (DNA lõigud pikkusega 50bp-1,5kbp) paiknevad promootorpiirkonnast tuhandeid nukleotiide (isegi kuni 50000 bp) kaugemal 5'otsa pool ja ka geeni mittekodeerivas piirkonnas. Cis elemendid ja enhancer'id avaldavad oma reguleerivat toimet transkriptsioonile kui nendega seostuvad valkud, mida nim transkriptsiooni faktoriteks (trans-faktorid). Seostumine tagab DNA paindumise, nii et regulaatorvalk saab seostuda RNA polümeraasiga, peamiste transkriptsiooni faktoritega või teiste valkudega. Repressorid ja aktivaatorid on
39. Defineeri enhancer ja loetle enhanceri omadused. Missuguseid analüüsimeetodeid kasutatakse enhanceralade tuvastamiseks? Kauguste-tagant mõjuvad regulaatorelemendid on enhancer-id, mis on eukarüootsetele genoomidele väga iseloomulikud, samas kui bakteris nad peaagu täielikult puuduvad. Asuvad sadade kuni tuhandeteid aluspaaride kaugusel start-saidist, võivad asuda nii ülavoolu, intronites kui ka allavoolu. Enhancer'id on üldreeglina 50bp kuni 200bp pikad DNA järjestused sisaldades hulgaliselt transkriptsioonifaktorite sidumissaite. Arvatakse, et need TFid, mis ühele enhacer'ile seovad, interakteeruvad ka omavahel. - interferooni (valk, mis inimesel on viirusinfektsiooni blokkijaks) ca 70bp enhancer'i uurimine on näidanud, et see koosneb 4 regulaatorelemendist, mis seovad samaaegselt nelja TFi. Väikeste HMG (kromatiini siduvad, rakus väga kõrgelt ekspresseeritud valgud) valkude juuresolekul on see
segmente, millede ümberkorraldusel - saab L ahela ( või ) - variaabel (VJ) piirkonda kodeeriv ala. H- ahelate perekonnad sisaldavad V, D, J ja C geeni- segmente, millede ümberkorraldusel - saab H ahela variaabelpiirkonda (VDJ) kodeeriv ala. Mõlemil juhul C segmendid - kodeerivad antikeha konstantset (C) piirkonda. V ja C piirk. kodeerivad geenisegmendid (kõik ca 300 bp ehk üks domään) on genoomi eri osades, nende ühinemine V+C toimub enne ekspressiooni. J ja D segmendid (30-50bp) on olulised antikehade mitmekesisuse loomisel. Lookuse ümberkorraldamine toimub alati kindla korra järgi: Antikeha VH piirkond: D+JDJ+V; Antikeha VL piirkond: V+J. V ja C piirkondi kodeerivad geenide segmendid asuvad genoomi (DNA) eri piirkondades. Erinevaid V segmente on palju; C segmente vähem; nende vahel on mittekodeerivad alad (intronid). V segmendid on 5'suunalised; C segmendid on 3'suunalised. Iga V eksoni ees on 90 bp kodeeriv ala (leader peptide), mis
annaabi.ee 
