4x separating( stacking) buffer 2,5 ml 1,25 ml 40% 2,5 ml 0,5 ml acrylamide(AA)/bisacrylamid e 37,5:1 (Bio-Rad) APS 100 µl 100 µl TEMED 10 µl 10 µl Lõpp-maht 10ml 5 ml · Eeskija järgi segame kõik komponendid kahe tuubisse. · APS ja TEMED on katalüsaatorid. Nad kiirendavad valgu tardumist. · Geeli valmistamisel paneme APS-i mõlemasse tuubisse korraga, aga TEMED-i esi algul ainult alumise geeli tuubisse, sest lahused polümeriseeruvad väga kiiresti. · Paneme kokku vajaliku aparatuuri ja lisame kahe klaasi vahele alumist geeli. Siis lisame natuke vett selleks ,et geel tarduks kõikides kohtades ühtlaselt. Kui alumine geel on
acrylamide(AA)/bisacryl amide 37,5:1 (Bio-Rad) APS 100 µl 100 µl TEMED 10 µl 10 µl Lõpp-maht 10ml 5 ml Eeskirja järgi segame kõik komponendid kahte tuubi. APS ja TEMED on katalüsaatorid, kiirendades geeli tardumist. Geeli valmistamisel paneme APS-i mõlemasse tuubi korraga, aga TEMED-i algul ainult alumise geeli tuubisse, sest lahused polümeriseeruvad väga kiiresti. Paneme kokku vajaliku aparatuuri ja lisame kahe klaasi vahele alumist geeli. Siis lisame natuke vett selleks, et geel tarduks kõikides kohtades ühtlaselt. Kui alumine geel on tardunud valame vee välja, lisame ülemise geeli tuubi TEMED-i ja valame kahe klaasi vahele. Paneme hambad peale ja ootame, kuni geel tardub. Kui geel on tardunud võtame hambad ja klaasid ära ning paneme
H2O 10 x PCR puhver (Fermentas) 25 mM MgCl2 Taq DNA polümeraas, 5 u/l (Fermentas) 2 mM dNTP (Fermentas) T3 ja T7 RNA polümeraasi promootori praimerid AATTAACCCTCACTAAAGGG ja TAATACGACTCACTATAGGG, 100 ng/l Töö käik: A: Restriktsioon (1) Restriktsioon: 1) 20 µl plasmiidsed DNA-d 22 µl 2) 2 µl 10x restriktaasi puhvrit Saadud 22 µl lahust jagan kaheks tuubiks, mõlemad 11 µl. Ühele tuubisse lisan 1 µl Cfr 421, teisele ei lisa, see on kontroll proov. Mõlemad tuubid inkubeerin 37 kraadi juures 1 tund. (2) Analüüsi saadud restriktsioon 0,8% 1 x TBE- agaroos-geelil (valmistamist vt eelmine praktikum). Iga üliõpilane kannab geelile kaks rada: kontroll ja restriktsioon: selleks lisada mõlemasse tuubi 10 l 1 x TBE foreesi pealekandmis-puhvrit (lilla). Ühisele geelile tuleb lisada ka molekulmassi marker DNA,
annaabi.ee 
