12. a. Kasutasime keemilist meetodit. Selleks lahjendasime DMEM-is eraldi DNA ja PEI ning seejärel segasime lahused kokku. DEI moodustab DNA-ga kompleksid. Pipeteerisime tranfektsioonisegu plaadile ning lisasime rakususpensiooni. DEI soodustab DNA seostumist rakumembraaniga, fagotsütoosi teel sisenevad DNA:DEI kompleksid rakku. b. Tranfektsiooniprotokoll: 1. Rakkude vaatlemine mikroskoobis, rakkude seisukorra ja tiheduse hindamine. 2. Transfektsioonisegu ettevalmistus. Kõigepealt tuleb lahjendada seerumvabas rakusöötmes (DMEM) eraldi epsides DNA ja PEI. Võta kolm 1,5 ml epsi. Pipeteeri kõigepealt DMEM, siis lisa esimesse kahte epsi á 0,5 µg plasmiidi (DNA) lahust (kontsentratsioone vaata lisa 2); Kolmandasse epsi sega kokku kõigi transfektsioonide kohta DMEM ja PEI (1µg DNA kohta 2µl PEI-d). DNA:PEI suhe sõltub rakuliinist, vaja optimiseerida. 25 µl DMEM + pEGFP (250 ng/µl), 500 ng = 2 µl.
replitseerub episomaalsena rakuliinides, kus on ekspresseeritud SV40 viiruse large T-antigen (Cos1, Cos7), mis tähendab tugevamat ekspressiooni 124. 125. 126. 127. 128. 129. 130. 131. Esimene päev – rakkude transfekteerimine PEI-ga 132. Esmalt tuleb vaadelda rakkud mikroskoobis ja hinnata nende seisukorra. Rakud ei ole saastanud ega surnud. Rakkude tihedus on umbes 95%. 1. Transfektsioonisegu ettevalmistamine. Võta 3 1,5 ml epsi. Esimeses segada 25 μl DMEMi ja 2 μl pEGFPd. Teises segada 25 μl DMEMi ja 0,5 μl pEGFP/FoxO3a Kolmandas segada 50 μl DMEMi ja 2 μl PEI lahust. 2. Jagada segu kolmandast epsist võrdselt DNA segudele (26 μl kaupa), segada läbi, fuugida ja inkubeerida 10-15 min toatemperatuuril. Selles etapis tekivad DNA ja PEI kompleksid, lahus muutub häguseks. 3
cytoplasm. If the polyplex unpacks then the DNA is free to diffuse to the nucleus.] PEI is extremely cytotoxic, by two different mechanisms, the disruption of the cell membrane leading to necrotic cell death (immediate) and disruption of the mitochondrial membrane after internalisation leading to apoptosis (delayed). Esialgu tuleb vaadelda rakkud mikroskoobis ja hinnata nende seisukorra ja tiheduse. Rakud ei ole saastanud ega surnud. Rakkude tihedus on umbes 90%. Transfektsioonisegu ettevalmistamine: Kõigepealt tuleb lahjendada seerumvabas rakusöötmes (DMEM) eraldi epsides DNA ja PEI. • Esimeses epsis segada 25 μl DMEMi ja 2 μl pEGFP-C1d (250 ng/μl) kontrollplasmiid – sisaldab pEGFP, ehk kui transfekteerimine õnnestub, rakud peavad flouriseerima flouristent mikroskoobi all. • Teises epsis segada 25 μl DMEMi ja 0,5 μl pEGFP/FoxO3a (conc 1000
annaabi.ee 
