(8) Kuumuta 95 oC, 2-3 min (DNA denatureerub, ahelad eralduvad) ja jahuta jääl. (9) Säilita selliselt saadud fluorestsents-märgitud DNA 4oC juures, kuni automaatsekvenaatorisse panemiseni. 15 Lisaülesanded: 5.1) Sekveneerimissegu sisaldab nii dNTP kui ddNTP, mis on nende erinevus? dNTP-desoksü, ddNTP-didesoksü (2' ja 3' asendites vesinikud, terminaatornukleotiid). ddNTP ei inkorporeeru nii hästi, pannakse lahusesse suure kontsentratsiooniga (ülehulgas). 5.2) Kui ddNTP inkorporeerub kasvavasse DNA ahelasse, miks ekstensioon termineerub? 3' otsas on vesinik, ei saa moodustuda fosfodiesterside järgmise nukleotiidiga. 5.3) Pikemad järjestused (>1000 nt) sekveneeritakse järestuse otstest kahe erineva vastassuunalise praimeriga kahes erinevas katseklaasis. Miks ei teostata sekveneerimist kahe erineva praimeriga ühes katseklaasis?
nukleotiide (didesoksüNTP-d e. ddNTP), millel puuduvad sünteesi jätkamiseks vajalikud 3’-OH rühmad. Kõigepealt liituvad DNA praimerid DNA maatriksmolekuliga täpselt samast kohast, siis seondub sinna DNA polümeraas. Piisava koguse algmaterjali ja reaktsioonikemikaalide korral toimub süntees samaaegselt paljudelt DNA molekulidelt ja reaktsioonianumas tekib igas pikkuses fragmente. Igas reaktsioonisegus on madalas kontsentratsioonis ka üks terminaatornukleotiid, mis lõpetab DNA-fragmendi sünteesi kas A-, G-, C- või T-terminaatoriga. Ahela terminaatoritena kasutatakse enamasti ddTNP-sid, kus puuduvad 3-OH rühmad. 32. Kirjeldage pürosekveneerimise protseduuri. 4:15-22. DNA mass- sekveneerimise meetod, kus erinevalt Sangeri didesoksüribonukleotiididega DNA-ahela sünteesi terminatsioonist kasutatakse sünteesiga järjestamist, mispuhul detekteeritakse nukleotiidide lülitamisel toimuvat pürofosfaadi vabanemist. 33
segmentide parve analüüsis PAAG- elektroforeesil, pärast southern- ülekannet fragmnetide visualiseerimises membraanfiltrite autoradiograafial. DNA ahel katkestatase keemiliste ainetega. Sangeri meetod põhineb in vitro DNA sünteesil radioaktiivselt märgistatud nukleotiidide ja spetsiifiliste DNA ahela terminaatornukleotiidide juuresolekul. Ka siin on erinevaid reaktsioonisegusid 4, kus lisaks radioaktiivselt märgistatud nukleotiididele on ka üks terminaatornukleotiid, mis lõpetab DNA sünteesi kas A, G, C või T-terminaatoriga, enamasti kasutatakse ddTNP-sid. Tänapäeval kasutatakse fluorestsentmärgitusi, fragmendid jaotatakse PAAG- elektroforeesil erinevates geelides või kapillaartorudes, fragmentide avastamiseks kasutatakse fototundlikke elemente. 45. Polümeraasi ahelreaktsioon. Polümeraasi ahelreaktsioon ehk PCR on meetod DNA või RNA järjestuse amplifikatsiooniks ehk kordistamiseks
annaabi.ee 
