3. Pesta 3 korda 5 minutit 1 ml PBS-Tweeniga. 4. Pesta 2 korda 5 minutit 1 ml PBSiga. 5. Pesta 1 kord 1 ml milliQ (destilleeritud) veega. VI Alusklaasidele panemine ehk sulundamine 1. Kirjuta alusklaasile oma nimi ja kuupäev, samuti kasutatud antikeha. 2. Pigistada tuubist alusklaasidele väike tilk DAPIga sulundamislahust. 3. Võta katteklaas pintsettide vahele ja kuivata serv vastu pehmet paberit. 4. Aseta katteklaas (rakud allpool !!!) sulundamislahuse tilga sisse (väldi mulle). 5. Lasta kuivada ja säilitada pimedas. b. Lahjenduste tegemise arvutused: 1) Primaarse antikeha lahjendus: Vaja on 400 µl lahust, kuna meil on 2 klaasi, kummagi kohta 200 µl. 2% BSA tuleb lahjendada 0,2%, seega tuleb lahjendada 10x, 10% lahusest peab olema BSA, seega tuleb võtta 400/10=40 µl. Antikeha peab olema 1:500, seega tuleb lahjendada 500 korda, seega 400/500=0,8 µl. 2) Sekundaarse antikeha lahjendus: BSA lahjendus sama, mis primaarse antikeha puhul.
Pesta 2 korda 5 minutit 1 ml PBSiga. Pesta 1 kord 1 ml MQga. 3. Alusklaasidele panemine ehk sulundamine. Kirjutada alusklaasile oma nimi, kuupäev ja kasutatud antikeha. Pigistada tuubist alusklaasidele väike tilk DAPIga sulundamislahust. Sulundamislahuses olev DAPI seondub rakus DNAga ja fluorestseerub siniselt. Võta katteklaas pintsettide vahele ja kuivatada serv vastu pehmet paberit. Asetada katteklaas (rakud allpool!) sulundamislahuse tilga sisse (vältida mulle) Lasta kuivada ja säilitada pimedas 157. 158. Kolmas päev – fluorestsentsmikroskoopia 159. Fluorestsentsmikroskoobi tööpõhimõte: ergastav valgus juhitakse läbi filtri uuritava objektini. Filter laseb läbi ainult kindla lainepikkusega valgust, mis on sobiv fluorokroomi ergastamiseks. Emiteeritud valgus sorteeritakse palju tugevamast ergastavast valgusest teise filtri abil. 160
• Pigistada tuubist alusklaasidele väike tilk DAPIga sulundamislahust. Sulundamislahuses olev DAPI seondub rakus DNAga ja fluorestseerub siniselt. Sulundamislahus “kleebib” rakku Dega katteklaasi alusklaasile ning aitab preparaadil pikemaajaliselt säilida ning ei lase fluorokroomidel aja jooksul tuhmuda. • Võta katteklaas pintsettide vahele ja kuivatada serv vastu pehmet paberit. • Asetada katteklaas (rakud allpool) sulundamislahuse tilga sisse, vältides mulli tekkimist • Lasta kuivada ja säilitada pimedas (valgustundlik!) Kolmas päev – fluorestsentsmikroskoopia Oma rakkude vaatlemiseks kasutame 60x õliobjektiivi, mille kasutades tuleb esmalt katteklaasile lisada tilk immersiooniõli. Vaatlesime rakke rohelises, punases ja sinises kanaalis: Figure 4. pEGFP/FoxO3a-ga transfekteerunud rakud. Roheline – FoxO3 liitvalk (ekspresseerub koos EGFPga
annaabi.ee 
